用于生成戊二酸和戊二酸甲酯的方法技术

本文件描述了用于生成戊二酸、5‑氨基戊酸、5‑羟基戊酸、尸胺或1,5‑戊二醇的生物化学途径，其通过在C5主链底物，诸如丙二酰基‑CoA或丙二酰基‑[acp]中形成一个或两个由羧基、胺或羟基基团构成的末端官能团进行。

Process for the production of glutaric acid and glutaric acid methyl ester

This document describes the biochemical pathways for generation of glutaric acid, 5 amino acid, 5 hydroxyisovaleric acid, cadaverine or 1,5 diol, the main chain of C5 substrates, such as CoA or C two C two acyl acyl formed in the [acp] of terminal groups of one or two by carboxyl, amine a group or hydroxyl group.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于生成戊二酸和戊二酸甲酯的方法对相关申请的交叉引用本申请要求于2014年6月16日提交的美国临时申请号62/012,722和于2014年6月16日提交的美国临时申请号62/012,586的权益，其公开内容通过引用整体并入本文。专利
本专利技术涉及提高具有羧酸还原酶活性的多肽对二羧酸的活性的方法，其通过使用具有丙二酰基-CoA甲基转移酶活性的多肽将二羧酸酶促转化为甲酯进行。本专利技术还涉及用于使用一种或多种具有丙二酰基-[acp]O-甲基转移酶，酯酶，脱水酶，水合酶，脱氢酶，硫酯酶，可逆的CoA连接酶，CoA-转移酶，羧酸还原酶，或ω-转氨酶活性的多肽生物合成戊二酸，5-氨基戊酸，尸胺，5-羟基戊酸，或1,5-戊二醇(下文为“C5构件块”)的方法，和生成此类C5构件块的重组宿主。
技术介绍
尼龙是聚酰胺，其一般通过二胺与二羧酸的缩合聚合(condensationpolymerization)合成。类似地，可以通过内酰胺的缩合聚合生成尼龙。一种普遍存在的尼龙是尼龙6,6，其通过六亚甲基二胺(HMD)和己二酸的缩合聚合生成。可以通过己内酰胺的开环聚合生成尼龙6(Anton&Baird,PolyamidesFibers,EncyclopediaofPolymerScienceandTechnology,2001)。尼龙5，尼龙5,5和包括C5单体的其它变体代表在许多应用中与尼龙6和尼龙6,6相比具有增值特性的新型聚酰胺。通过5-氨基戊酸的聚合生成尼龙5，而通过戊二酸和尸胺的缩合聚合生成尼龙5,5。不存在经济可行的石油化学路线以生产尼龙5和尼龙5,5的单体。鉴于没有经济上可行的石油化学单体原料，生物技术通过生物催化提供了备选方法。生物催化是使用生物催化剂，如酶，来进行有机化合物的生物化学转化。生物来源的原料和石油化学原料两者都是用于生物催化过程的可行的起始材料。因而，针对此背景，清楚的是需要用于生产戊二酸，5-羟基戊酸，5-氨基戊酸，尸胺和1,5-戊二醇(下文称为“C5构件块”)中的一种或多种的可持续的方法，其中所述方法是基于生物催化的。然而，野生型的原核生物或真核生物不过度生成C5构件块到细胞外环境。但是，戊二酸，5-氨基戊酸和尸胺的代谢已有报道。许多细菌和酵母经由β-氧化将二羧酸己二酸作为碳源高效转化为中心代谢产物。辅酶A(CoA)活化的戊二酸至巴豆酰基-CoA的脱羧促进经由β-氧化的进一步分解代谢。已经对厌氧细菌，如Clostridiumviride报道了5-氨基戊酸的代谢(Buckeletal.,2004,Arch.Microbiol.,162,387-394)。类似地，可以将尸胺降解成乙酸和丁酸(RoederandSchink,2009,Appl.Environ.Microbiol.,75(14),4821–4828)。最优性原理叙述，微生物调节它们的生物化学网络来支持最大生物质(biomass)生长。超出在宿主生物体中表达异源途径的需要，将碳通量引导到充当碳源的C5结构单元而非生物质生长组分与最优性原理矛盾。例如，将1-丁醇途径从梭菌属(Clostridium)物种转移至其它生产菌株与天然生产者的生产性能相比经常相差一个数量级(Shenetal.,Appl.Environ.Microbiol.,2011,77(9):2905–2915)。5碳脂肪族主链前体的有效合成是在C5脂肪族主链上形成末端官能团，如羧基，胺或羟基基团前合成一个或多个C5构件块的关键考虑。专利技术概述本文件至少部分基于下述发现：可以构建用于从丙二酰基-[acp]或丙二酰基-CoA生成5碳链主链前体，诸如戊二酰基-[acp]，戊二酰基-CoA或戊二酸甲酯的生物化学途径，其中可以形成一个或两个官能团，即羧基、胺或羟基，导致下列一项或多项的合成：戊二酸、5-羟基戊酸、5-氨基戊酸、尸胺(又称为1,5戊二胺)，和1,5-戊二醇(下文为“C5构件块”)。戊二酸半醛(又称为5-氧代戊酸)可以作为其它产物的中间体生成。戊二酸和戊二酸盐、5-羟基戊酸和5-羟基戊酸盐、5-氧代戊酸和5-氧代戊酸盐、和5-氨基戊酸和5-氨基戊酸盐可互换使用，指任何其中性或离子化形式的化合物，包括其任何盐形式。本领域技术人员理解，特定的形式将取决于pH。在一些实施方案中，可以经由转化为戊二酰基-[acp]甲酯或戊二酰基-CoA甲酯，接着(i)分别将戊二酰基-[acp]甲酯或戊二酰基-CoA甲酯脱酯化(de-esterification)为戊二酰基-[acp]或戊二酰基-CoA，或(ii)将戊二酰基-[acp]甲酯或戊二酰基-CoA甲酯水解为戊二酸甲酯，从丙二酰基-[acp]或丙二酰基-CoA形成用于转化为C5构件块的C5脂肪族主链。参见图1-3。在一些实施方案中，产生C5脂肪族主链的途径中的酶有目的地含有不可逆的酶步骤。在一些实施方案中，可以使用酯酶、硫酯酶、可逆的CoA连接酶、CoA转移酶、醛脱氢酶、7-氧代庚酸脱氢酶、6-氧代己酸脱氢酶或5-氧代戊酸脱氢酶酶促形成末端羧基基团。参见图4。在一些实施方案中，可以使用ω-转氨酶或脱乙酰基酶酶促形成末端胺基团。参见图5–7。在一些实施方案中，可以使用醇脱氢酶、4-羟基丁酸脱氢酶、5-羟基戊酸脱氢酶和6-羟基己酸脱氢酶酶促形成末端羟基基团。参见图8和图9。硫酯酶可以与SEQIDNO.22-23，SEQIDNO:17-18中列出的氨基酸序列具有至少70％序列同一性(同源性)(例如至少75％，80％，85％，90％，95％，97％，98％，99％，或100％)。ω-转氨酶可以与SEQIDNO.8-13中列出的氨基酸序列的任一项具有至少70％序列同一性(同源性)(例如至少75％，80％，85％，90％，95％，97％，98％，99％，或100％)。羧酸还原酶(例如与磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶组合)可以在形成产物中形成末端醛基团作为中间体。羧酸还原酶可以与SEQIDNO.2-7中列出的氨基酸序列的任一项具有至少70％序列同一性(同源性)(例如至少75％，80％，85％，90％，95％，97％，98％，99％，或100％)。在一个方面中，本文件特征在于在重组宿主中生物合成戊二酸半醛甲酯的方法。方法包括使用至少一种具有丙二酰基-CoAO-甲基转移酶活性的多肽和至少一种具有硫酯酶活性的多肽将丙二酰基-[acp]和丙二酰基-CoA中的至少一种酶促转化为戊二酸甲酯。在一些实施方案中，使用至少一种具有丙二酰基-CoAO-甲基转移酶活性的多肽将丙二酰基-[acp]酶促转化为丙二酰基-[acp]甲酯。可以使用至少一种具有选自下组的活性的多肽将丙二酰基-[acp]甲酯酶促转化为戊二酰基-[acp]甲酯：合酶活性，脱氢酶活性，脱水酶活性，和还原酶活性。可以使用至少一种具有硫酯酶活性的多肽将戊二酰基-[acp]甲酯酶促转化为戊二酸甲酯。在一些实施方案中，使用至少一种具有丙二酰基-CoAO-甲基转移酶活性的多肽将丙二酰基-CoA酶促转化为丙二酰基-CoA甲酯。在一些实施方案中，使用至少一种具有选自下组的活性的多肽将丙二酰基-CoA甲酯酶促转化为戊二酰基-CoA甲酯：合酶活性，β-酮硫解酶活性，脱氢酶活性，水合酶活性，和还原酶活性。权利要求7的方本文档来自技高网...

【技术保护点】
在重组宿主中生物合成戊二酸甲酯的方法，所述方法包括使用至少一种具有丙二酰基‑CoA O‑甲基转移酶活性的多肽和至少一种具有硫酯酶活性的多肽在所述宿主中将丙二酰基‑[acp]和丙二酰基‑CoA中的至少一种酶促转化为戊二酸甲酯。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.06.16 US 62/012,586;2014.06.16 US 62/012,7221.在重组宿主中生物合成戊二酸甲酯的方法，所述方法包括使用至少一种具有丙二酰基-CoAO-甲基转移酶活性的多肽和至少一种具有硫酯酶活性的多肽在所述宿主中将丙二酰基-[acp]和丙二酰基-CoA中的至少一种酶促转化为戊二酸甲酯。2.权利要求1的方法，其中使用所述至少一种具有丙二酰基-CoAO-甲基转移酶活性的多肽将丙二酰基-[acp]酶促转化为丙二酰基-[acp]甲酯。3.权利要求2的方法，其中使用至少一种具有选自下组的活性的多肽将丙二酰基-[acp]甲酯酶促转化为戊二酰基-[acp]甲酯：合酶活性，脱氢酶活性，脱水酶活性，和还原酶活性。4.权利要求3的方法，其中使用所述至少一种具有硫酯酶活性的多肽将戊二酰基-[acp]甲酯酶促转化为戊二酸甲酯。5.权利要求1的方法，其中使用所述至少一种具有丙二酰基-CoAO-甲基转移酶活性的多肽将丙二酰基-CoA酶促转化为丙二酰基-CoA甲酯。6.权利要求5的方法，其中使用至少一种具有选自下组的活性的多肽将丙二酰基-CoA甲酯酶促转化为戊二酰基-CoA甲酯：合酶活性，β-酮硫解酶活性，脱氢酶活性，水合酶活性，和还原酶活性。7.权利要求6的方法，其中使用所述至少一种具有硫酯酶活性的多肽将戊二酰基-CoA甲酯酶促转化为戊二酸甲酯。8.权利要求1-7中任一项的方法，其中所述具有丙二酰基-CoAO-甲基转移酶活性的多肽与SEQIDNO:21中列出的氨基酸序列具有至少70％序列同一性。9.权利要求3、4、或6-8中任一项的方法，其中所述具有还原酶活性的多肽与SEQIDNO:19或20中列出的氨基酸序列具有至少70％序列同一性。10.权利要求1-9中任一项的方法，所述方法进一步包括使用至少一种具有羧酸还原酶活性的多肽在所述宿主中将戊二酸甲酯酶促转化为戊二酸半醛甲酯。11.权利要求10的方法，其进一步包括使用至少一种具有选自下组的活性的多肽将戊二酸半醛甲酯酶促转化为5-氨基戊酸：ω-转氨酶活性和酯酶活性。12.权利要求11的方法，其进一步包括使用至少一种具有选自下组的活性的多肽将5-氨基戊酸酶促转化为尸胺：羧酸还原酶活性，ω-转氨酶活性，N-乙酰基转移酶活性，醇脱氢酶活性，和脱乙酰基酶活性.13.权利要求1的方法，所述方法进一步包括使用至少一种具有选自下组的活性的多肽将戊二酸甲酯酶促转化为5-氧代戊酸：羧酸还原酶活性和酯酶活性。14.权利要求13的方法，所述方法进一步包括使用至少一种具有选自下组的活性的多肽将5-氧代戊酸酶促转化为尸胺：羧酸还原酶活性，和ω-转氨酶活性活性。15.权利要求10的方法，所述方法进一步包括使用至少一种具有酯酶活性的多肽将戊二酸半醛甲酯酶促转化为5-羟基戊酸。16.权利要求15的方法，其中所述具有酯酶活性的多肽与SEQIDNO:16中列出的氨基酸序列具有至少70％序列同一性。17.权利要求15或权利要求16的方法，其进一步包括使用至少一种具有脱氢酶活性的多肽将戊二酸半醛甲酯酶促转化为5-羟基戊酸。18.权利要求15-17中任一项的方法，其进一步包括使用至少一种具有选自下组的活性的多肽将5-羟基戊酸酶促转化为尸胺：羧酸还原酶活性，ω-转氨酶活性，和醇脱氢酶活性。19.权利要求15-17中任一项的方法，其进一步包括使用至少一种具有选自下组的活性的多肽将5-羟基戊酸酶促转化为1,5-戊二醇：羧酸还原酶活性和醇脱氢酶活性。20.权利要求19的方法，其进一步包括使用至少一种具有选自下组的活性的多肽将1,5-戊二醇酶促转化为尸胺：ω-转氨酶活性和醇脱氢酶活性。21.权利要求1-9中任一项的方法，所述方法进一步包括使用至少一种具有酯酶活性的多肽将戊二酸甲酯酶促转化为戊二酸。22.权利要求21的方法，所述方法进一步包括使用至少一种具有羧酸还原酶活性的多肽和至少一种具有ω-转氨酶活性的多肽将戊二酸酶促转化为5-氨基戊酸。23.权利要求21的方法，所述方法进一步包括使用至少一种具有羧酸还原酶活性的多肽和至少一种具有EC1.1.1.-下分类的脱氢酶活性的多肽将戊二酸酶促转化为5-羟基戊酸。24.权利要求10-20、22和23中任一项的方法，其中所述具有羧酸还原酶活性的多肽与SEQIDNO:2-7中列出的任一项的氨基酸序列具有至少70％序列同一性。25.权利要求1-22中任一项的方法，其中所述具有硫酯酶活性的多肽与SEQIDNO:17，18，22，和23中列出的任一项氨基酸序列具有至少70％序列同一性。26.权利要求11，12，14，18，20，和22中任一项的方法，其中所述具有ω-转氨酶活性的多肽与SEQIDNO:8-13中列出的任一项氨基酸序列具有至少70％序列同一性。27.生成戊二酸的方法，所述方法包括(i)使用具有庚二酰-[acp]甲酯甲基酯酶活性的多肽将戊二酰基-[acp]甲酯酶促转化为戊二酰基-[acp]或将戊二酰基-CoA甲酯酶促转化为戊二酰基-CoA，并且(ii)使用至少一种具有硫酯酶活性，可逆的CoA连接酶活性，CoA转移酶活性，酰化脱氢酶活性，醛脱氢酶活性，戊二酸半醛脱氢酶活性，或琥珀酸半醛脱氢酶活性的多肽将戊二酰基-[acp]或戊二酰基-CoA酶促转化为戊二酸。28.权利要求27的方法，其中所述具有庚二酰-[acp]甲酯甲基酯酶活性的多肽与SEQIDNO:1中列出的氨基酸序列具有至少70％序列同一性。29.权利要求27或权利要求28的方法，其中使用具有硫酯酶活性的多肽将戊二酰基-[acp]或戊二酰基-CoA酶促转化为戊二酸。30.权利要求27或权利要求28的方法，其中使用具有可逆的CoA连接酶活性或CoA转移酶活性的多肽将戊二酰基-[acp]或戊二酰基-CoA酶促转化为戊二酸。31.权利要求27或权利要求28的方法，其中使用具有酰化脱氢酶活性，醛脱氢酶活性，戊二酸半醛脱氢酶活性，或琥珀酸半醛脱氢酶活性的多肽将戊二酰基-[acp]或戊二酰基-CoA酶促转化为戊二酸。32.权利要求1-31中任一项的方法，其中所述宿主经受需氧或微需氧培养条件下的培养策略。33.权利要求1-32中任一项的方法，其中经由氮、磷酸盐或氧限制在营养限制的条件下培养所述宿主。34.权利要求1-33中任一项的方法，其中使用陶瓷膜保留所述宿主以在发酵期间维持高细胞密度。35.权利要求1-34中任一项的方法，其中补料到发酵的主要碳源源自生物原料。36.权利要求35的方法，其中所述生物原料是源自单糖，二糖，木质纤维素、半纤维素、纤维素、木质素、乙酰丙酸和甲酸、甘油三酯、甘油、脂肪酸、农业废物、浓缩酒糟(condenseddistillers'solubles)或城市废物。37.权利要求1-34中任一项的方法，其中补料到发酵的主要碳源源自非生物原料。38.权利要求37的方法，其中所述非生物原料是源自天然气、合成气、CO2/H2、甲醇、乙醇、苯甲酸盐、非挥发性残留物(NVR)或来自环己烷氧化过程的碱洗液(causticwash)废物流、或对苯二甲酸/异酞酸混合物废物流。39.权利要求1-38中任一项的方法，其中所述宿主是原核生物。40.权利要求39的方法，其中所述原核生物选自下组：埃希氏菌属(Escherichia)；梭菌属(Clostridia)；棒状杆菌属(Corynebacteria)；贪铜菌属(Cupriavidus)；假单胞菌属(Pseudomonas)；代尔夫特菌属(Delftia)；芽孢杆菌属(Bacilluss)；乳杆菌属(Lactobacillus)；乳球菌属(Lactococcus)；和红球菌属(Rhodococcus)。41.权利要求40的方法，其中所述原核生物选自下组：大肠杆菌(Escherichiacoli)、杨氏梭菌(Clostridiumljungdahlii)、自产乙醇梭菌(Clostridiumautoethanogenum)、克鲁佛梭菌(Clostridiumkluyveri)、谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumglutamicum)、钩虫贪铜菌(Cupriavidusnecator)、耐金属贪铜菌(Cupriavidusmetallidurans)、荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)、恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)、食油假单胞菌(Pseudomonasoleavorans)、食酸代尔夫特菌(Delftiaacidovorans)、枯草芽胞杆菌(Bacillussubtillis)、德氏乳杆菌(Lactobacillusdelbrueckii)、乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)、和马红球菌(Rhodoco...

【专利技术属性】
技术研发人员：AL博特斯，AVE康拉迪，
申请(专利权)人：英威达技术有限责任公司，
类型：发明
国别省市：瑞士,CH