人类乳头瘤病毒构建体制造技术

本发明专利技术实施方式提供用于重组生成蛋白或多肽的无标签构建体的组合物和方法。在某些实施方式中，本文中揭示的重组蛋白或多肽涉及人类乳头瘤病毒(HPV)。其它实施方式涉及在组合物中使用这些构建体来诱发受试者对一种或多种HPV类型的免疫反应。还揭示了用来预防和治疗病毒感染的治疗性和预防性疫苗。提供了为本文中预期的构建体编码的核酸和表达载体。在某些实施方式中，生成的HPV衣壳蛋白没有融合标签。另外，预期了HPV L1的截短形式。

Human papillomavirus construct

Embodiments of the present invention provide compositions and methods for the construction of unlabeled constructs for the generation of proteins or polypeptides. In some embodiments, recombinant proteins or polypeptides disclosed herein relate to human papillomavirus (HPV). Other embodiments involve using these constructs in the composition to induce subjects to respond to one or more HPV types of immune responses. Therapeutic and prophylactic vaccines for the prevention and treatment of viral infections are also disclosed. Nucleic acids and expression vectors are provided for coding the desired constructs in this paper. In some embodiments, the resulting HPV capsid protein has no fusion tag. In addition, the truncated form of HPV expected L1.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】人类乳头瘤病毒构建体政府资助本专利技术是在美国国家卫生研究院颁布的授权号为CA098252的政府资助下完成的。政府享有本专利技术中的某些权力。优先权本PCT申请主张2014年6月19日提交的美国临时申请No.62/014,495的优先权。为了各种目的该申请作为一个整体通过引用而并入本文中。专利
本专利技术的实施方式为预防、治疗和/或诊断人类乳头瘤病毒感染及与此相关的宫颈癌提供新型疫苗和诊断试剂。本文中一些实施方式涉及没有标签、跟踪剂或融合元素的人类乳头瘤病毒(HPV)构建体。这些制品能够用于在受试者中诱发对目标HPV的免疫反应。在某些实施方式中，由本文中揭示的组合物和方法生成的HPV构建体是壳粒。
技术介绍
乳头瘤病毒是能够感染多种不同种类的动物(包括人类在内)的致病性病毒。乳头瘤病毒感染的特征通常表现为诱发上皮和纤维上皮肿瘤，或者位于感染位点的疣。每个种类的脊椎动物都可以被一组物种特异性的乳头瘤病毒感染。例如，迄今为止，已分离了超过100种不同的人类乳头瘤病毒基因型。乳头瘤病毒是高度物种特异性的感染性试剂。尚未确认犬和兔乳头瘤病毒会在异源物种(如人类)体内诱发乳头瘤。抗一种乳头瘤病毒型感染的免疫力通常似乎不会赋予抗另一种类型的免疫力，即使这些类型的乳头瘤病毒感染同源物种时。乳头瘤病毒诱发生殖器疣，这是一种流行性人类性传播疾病。HPV6型和11型通常多与良性的生殖器疣尖锐湿疣存在联系。生殖器疣非常普遍，并且相比于临床感染，亚临床的或不明显的HPV感染甚至更加普遍。尽管多数HPV诱发的病变是良性的，由某种乳头瘤病毒类型(如HPV-16和HPV-18)诱发的病变可能经历恶性进展，从而可能导致宫颈癌。涉及宫颈癌的HPV基因型中，HPV-16是最常见的，在大约50％的宫颈癌中都有发现。鉴于普遍由乳头瘤病毒感染造成的重大的健康风险，特别是人类乳头瘤病毒感染，许多团队已经报告了重组乳头瘤病毒抗原的进展及作为诊断试剂和预防性疫苗的用途。一般而言，这些研究集中在制造含有单独的主要衣壳蛋白(L1)或与次要衣壳蛋白(L2)组合的预防性疫苗。目前临床试验的预防性疫苗是基于VLPs(病毒样颗粒)。VLPs是72个五聚体或主要乳头瘤病毒衣壳蛋白L1的壳粒的集合体。然而，这些类型的疫苗的生产比较昂贵，因为需要真核表达系统或复杂的纯化，并且不如壳粒制品稳定。VLP疫苗不能提供针对其它乳头瘤病毒血清型的交叉保护，因为中和免疫反应倾向于类型特异性占主导。专利技术概述本文中揭示的实施方式提供没有亲和性或其它标签的人类乳头瘤病毒(HPV)壳粒，病毒衣壳的亚单位的有效组合物和生产方法，其中该构建体是无标签的。根据这些实施方式，可以采用本文中揭示的组合物和方法，从任何HPV物种生成该HPV壳粒。在其它实施方式中，本文中生成的HPV蛋白或多肽可以用于生成在所描述的免疫原性组合物中使用的壳粒。根据这些实施方式，本文中揭示的实施方式中的壳粒可以用于以成本效率高的、高效的和稳定的方式生产用于使受试者免疫的免疫原性组合物，从而降低HPV感染的发病或发展的风险或者治疗患有HPV感染的受试者。一些实施方式涉及使用产生HPV-蛋白的构建体来生成相比于标准方法大量的蛋白，同时消除了移除标签或融合分子的需要，使这一过程更加有效率。这些无标签构建体可以用来形成在本文中揭示的免疫原性组合物中使用的壳粒。本文中考虑的某些免疫原性组合物可以是药学上可以接受的组合物，这些组合物是用来生成疫苗的免疫原性组合物或用来使受试者对乳头瘤感染免疫的其它组合物。这些组合物可以用来在受试者中诱发对人类乳头瘤病毒的免疫反应以保护受试者免于HPV感染。描述了由本文中揭示的组合物产生的用来预防和/或治疗病毒性感染(如乳头瘤病毒感染、宫颈癌和与此相关的疣)的预防性疫苗。也揭示了组合物中使用的编码乳头瘤病毒构建体或多肽的核酸和表达载体。在一些实施方式中，用本文中揭示的方法生成的构建体可以用来在细菌表达系统中表达HPV多肽以快速和成本效率高地生成和纯化大量HPV多肽。根据这些实施方式，用这些方法生产的HPV多肽可以被用于药物组合物或其它组合物中。因为这些HPV多肽没有被融合或者不包含标签或其它跟踪分子，所以不需要进一步处理。其它实施方式进一步提供了使用本文中描述的无标签构建体生成的壳粒剂型。例如，完整结构的乳头瘤病毒蛋白L1可以用来生成无标签构建体。L1的序列是本领域熟知的并且可以在例如作为整体被并入本文中的U.S.Pat.No.6,228,368中找到。某些实施方式涉及HPVL1的截短形式。根据这些实施方式，本文中描述的HPVL1的截短形式可以包括具有位于N-端的至少3个且不超过24个氨基酸的截短和位于C-端的至多29个氨基酸的截短。根据这些实施方式，截短的L1蛋白可以形成五聚体壳粒亚单位并且可以包含HPV病毒粒子中发现的中和表位，但是缺乏形成如完整病毒衣壳或VLPs这样高阶结构的能力。附图说明下面的附图组成本说明书的一部分，并且用于进一步展示某些实施方式。通过单独参考一个或更多这些附图或者结合所提供的实施方式的详细描述，一些实施方式可以被更好的理解。图1说明了本文中揭示的某些实施方式中的示例性表达质粒的构建体。图2示出了图1所示的质粒构建体的琼脂糖凝胶电泳分离图像。图3示出了证实在大肠杆菌中表达/诱导L1蛋白的典型SDS-PAGE的图像。诱导时间在顶部的上图中表示(以小时为单位)。L1的位置由箭头指示。图4示出了与V5构象抗体的ELISA反应性。图5示出了确认特征五聚体的形成的电子显微照片。图6A-图6D示出了来自HPV假病毒中和试验的曲线图。图7示出了证实N-端缺失3、5或9个氨基酸的HPV16L1的表达的典型SDS-PAGE图像。图8示出了证实N-端缺失13或15个氨基酸的HPV16L1的表达的典型SDS-PAGE图像。图9示出了证实N-端缺失20或25个氨基酸的HPV16L1的表达的典型SDS-PAGE图像。图10示出了证实N-端缺失5或9个氨基酸的HPV18L1的表达的典型SDS-PAGE图像。图11示出了证实N-端缺失15或16个氨基酸的HPV18L1的表达的典型SDS-PAGE图像。具体实施方式在下面的部分，为了详细描述各种实施方式，描述了多种示例性组合物和方法。对本领域技术人员来说显而易见的是，实践各种实施方式不需要使用所有甚至部分的本文中所概述的细节，而是可以通过常规试验修改浓度、时间和其它细节。在一些情况中，描述中没有包括熟知的方法和组分。本文中揭示的组合物和方法涉及有效和低价地生产大量目标蛋白或多肽，其中未使用用于生产或分离的标签或融合多肽生产目标。可以预料的是，这些方法对快速生产目标蛋白并且避免与使用标签或其它跟踪剂相关的非必要步骤是有效的。之前描述了可以从融合蛋白形式的构建体表达乳头瘤病毒衣壳蛋白L1蛋白。这些融合蛋白在细菌生物中作为重组分子被表达时可以保持L1天然构象和免疫原性的活性，如由利用例如中和抗体的试验测定的。为了跟踪目标蛋白或多肽的合成和/或纯化，当前本领域熟知的蛋白或多肽构建体需要用于表达的标签，这就需要材料(如标签或示踪剂)和人力上的额外花费以从存储和后续使用的制品的最终产品中去除该标签。这些额外的要求减缓了生产过程，并且在某些情况中可以导致目标分子的制造本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种质粒构建体，包含：具有转录起始密码子的目标人类乳头瘤病毒(HPV)DNA分子，所述目标HPV DNA分子编码一种或多种蛋白或多肽；与所述目标HPV DNA分子相连、能够诱导所述目标HPV DNA转录的启动子；位于所述启动子和所述目标HPV DNA分子之间的限制位点；能够赋予对抗筛选剂的抗性基因，并且所述质粒构建体没有标签或跟踪分子，是无标签的。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.06.19 US 62/014,4951.一种质粒构建体，包含：具有转录起始密码子的目标人类乳头瘤病毒(HPV)DNA分子，所述目标HPVDNA分子编码一种或多种蛋白或多肽；与所述目标HPVDNA分子相连、能够诱导所述目标HPVDNA转录的启动子；位于所述启动子和所述目标HPVDNA分子之间的限制位点；能够赋予对抗筛选剂的抗性基因，并且所述质粒构建体没有标签或跟踪分子，是无标签的。2.根据权利要求1所述的质粒构建体，其中所述目标HPVDNA分子编码单一蛋白或嵌合蛋白。3.根据权利要求1所述的质粒构建体，其中所述目标HPVDNA编码在抗所述目标HPV的免疫原性组合物中使用的蛋白或多肽。4.根据权利要求1所述的质粒构建体，其中所编码的蛋白或多肽选自HPV6、HPV6a、HPV6b、HPV11、HPV16、HPV18、HPV30、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV42、HPV43、HPV44、HPV45、HPV51、HPV52、HPV54、HPV55、HPV56和HPV70中的一种或多种。5.根据权利要求1所述的质粒构建体，其中所述目标HPVDNA分子编码截短的HPVL1蛋白，所述截短的HPVL1蛋白具有下述中的至少一种：在N-端缺失3个且不超过24个氨基酸和在C-端缺失多达29个氨基酸。6.根据权利要求5所述的质粒构建体.其中产生的HPVL1蛋白或多肽形成壳粒。7.根据权利要求5所述的质粒构建体，其中编码所述多肽的所述目标DNA分子包括SEQIDNO.2。8.根据权利要求1所述的质粒构建体，其中所述启动子是Tac启动子。9.一种药物组合物，包括：一种或多种权利要求1所述的构建体和药学上可接受的载体。10.根据权利要求9所述的药物组合物，其中所述构建体包括HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV-35、HPV45、HPV52和HPV58中的至少一种构建体。11.一种在受试者中诱发对至少一种HPV类型的免疫反应的方法，所述方法包括向所述受试者施用组合物，以及在所述受试者中诱发对至少一种HPV类型的免疫反应，所述组合物包括一种或多种根据权利要求1所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：R·L·加西亚，D·G·梅思雅克，
申请(专利权)人：科罗拉多大学董事会，法人，
类型：发明
国别省市：美国,US