2,3-丁二醇的生成能力得到增加的重组微生物及利用其的2,3-丁二醇的生产方法技术

本发明专利技术涉及基因，上述基因对具有乙偶姻与2,3-丁二醇之间的转换活性的酶进行编码，并具有SEQ ID NO.12的碱基序列。并且，本发明专利技术涉及由上述基因进行编码的蛋白质。并且，本发明专利技术涉及上述蛋白质的活性受到抑制的重组微生物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及2,3-丁二醇的生成能力得到增加的重组微生物及利用其的2,3-丁二醇的生产方法。
技术介绍
作为具有四个碳和两个羟基(-OH)的乙醇中之一(CH3CHOHCHOHCH3)的2,3-丁二醇可使用作为合成橡胶制备工序的原料物质的1，3-丁二烯(1，3-Butadiene)、燃料添加剂及用作溶剂的甲基乙基酮(MEK，Methylethylketone)进行化学催化剂转换(Jietal.,Biotechnol.Adv.,29:351,2011)。并且，2,3-丁二醇与汽油(Gasoline)混合而可适用为辛烷助推器(octanebooster)，从而是产业上非常重要的中间体(Celinskaetal.,Biotechnol.Adv.,27:715,2009)。2,3-丁二醇可通过化学合成工序和微生物发酵工序来生产。但是，由于通过上述工序生产2,3-丁二醇的价格非常高，因而不生产商业性规模的2,3-丁二醇。另一方面，最近，随着与通过微生物发酵工序生产2,3-丁二醇技术的飞跃发展一同，对化石原料物质的价格急剧上升和国际环境污染的制约强化，从而对以通过微生物发酵的生物为基础的2,3-丁二醇生产的关心和研究开发的重要性增大。以通过微生物发酵工序的生物为基础的2,3-丁二醇的生产研究分为发酵工序最佳化(温度、pH、溶解氧等)和微生物开发(微生物挖掘、掌握生理学特性、突然变异、基因操作等)领域来进行。在发酵工序最佳化方面，查明了可有效生产2,3-丁二醇的温度、pH、溶解氧浓度等多种条件(Jietal.,Bioresour.Technol.,100:3410,2009；Nakashimadaetal.,J.Biosci.Bioeng.,90:661,2000；Nakashimadaetal.,Biotechnol.Lett.,20:1133,1998)。但是，由于通过上述条件下的微生物发酵工序的2,3-丁二醇生产的生产率(Productivity)及收率(Yield)仍然低，实际难以直接适用于商业工序。并且，在发酵过程中，存在与2,3-丁二醇一同，生成包含乳酸的多种有机酸(Organicacids)和包含乙醇的多种乙醇(Alcohols)等多种副产物(By-products)的缺点。副产物的生成不仅降低对生物原料物质的2,3-丁二醇的收率，而且在从培养液回收2,3-丁二醇的过程中需要巨大的分离及纯化费用。因此，有关2,3-丁二醇生产的微生物开发研究主要向减少副产物的方向进行。代表性地，Ji等通过向野生型产酸克雷伯菌菌株露出物理/化学突然变异方法中之一的紫外线(UV)，来成功地部分抑制了作为副产物的多种有机酸的生成(Jietal.,Biotechnol.Lett.,30:731,2008)。与此同时，将离子束(Ionbeam)方式适用于肺炎克雷伯菌菌株来增加生物质消耗速度，从而可提高2,3-丁二醇的生产(Maetal.,Appl.Microbiol.Biotechnol.,82:49,2009)。在有关通过选择性基因操作的副产物减少的研究中，去除参与作为主要副产物中之一的乳酸(Lacticacid)生成的基因(ldhA)来制备的变异微生物在一般条件下表示最佳的性能。并且，还有为了减少作为副产物的乙醇的生成而去除参与乙醇生成的基因(adhE、aldA)的例(Jietal.,Appl.Microbiol.Biotechnol.,85:1751,2010)。并且，还有在乳酸菌(LAB，lacticacidbacteria)中降低参与甲酸生成的酶(pyruvate-formatelyase)的活性的例(WO2010/037114A1)。本专利技术人确认了具有2,3-丁二醇的转换能力的基因，确认抑制上述基因的活性的重组微生物的2,3-丁二醇生成能力得到增加且所生成的2,3-丁二醇的消耗受到抑制，并完成了本专利技术。
技术实现思路
技术问题本专利技术的目的在于，提供2,3-丁二醇的生成能力得到增加的重组微生物及利用其的2,3-丁二醇的生产方法。技术方案为了达成上述目的，本专利技术提供基因，上述基因对具有乙偶姻与2,3-丁二醇之间的转换活性的酶进行编码，并具有SEQIDNO.12的碱基序列。并且，本专利技术提供重组载体，其特征在于，包含上述基因。并且，本专利技术提供由上述基因进行编码的蛋白质。并且，本专利技术提供重组微生物，其特征在于，上述蛋白质的活性受到抑制。并且，本专利技术提供2,3-丁二醇的生成能力得到增加的重组微生物，具有2,3-丁二醇及乳酸生物合成途径，其特征在于，上述蛋白质的活性受到抑制。并且，本专利技术提供2,3-丁二醇的生成能力得到增加的重组微生物，具有2,3-丁二醇及乳酸生物合成途径，其特征在于，具有乙偶姻与2,3-丁二醇之间的转换活性，向2,3-丁二醇的转换活性低于向乙偶姻的转换活性的酶受到抑制。并且，本专利技术提供2,3-丁二醇的生产方法，上述2,3-丁二醇的生产方法包括：对上述重组微生物进行培养的步骤；以及从通过上述步骤得到的培养液中回收2,3-丁二醇的步骤。专利技术的效果本专利技术的重组微生物增加2,3-丁二醇的生成能力，并减少已生产的2,3-丁二醇的消耗率。并且，根据重组微生物的培养的乙偶姻积累率低。附图说明图1表示2,3-丁二醇生成菌株中的2,3-丁二醇的生物合成途径(图1的(A)部分)及消耗途径(图1的(B)部分及图1的(C)部分)。图2图示有关存在于产酸克雷伯菌内的2,3-丁二醇合成的基因操纵子。图3中，为了确认有关存在于产酸克雷伯菌内的2,3-丁二醇合成的基因的细胞内功能，图示化大肠杆菌(E.coliJM109)表达重组载体制作过程。图4表示重组大肠杆菌的分批式发酵时2,3-丁二醇的生成能力，图5表示乙偶姻的生成能力(●：pBRbudRAB/E.coliJM109、▲：pBRbudRABC/E.coliJM109、■：pBRbudRABD/E.coliJM109)。图6为在M9最少培养基中，以2,3-丁二醇作为唯一的碳源来使重组克雷伯氏菌菌株生长的结果，图7为残留的2,3-丁二醇的浓度(●：KO△ldhA、▲：KO△dhA△budC、■：KO△ldhA△dar.◆：KO△ldhA△budC△dar.)。图8至图11表示分批式发酵多个重组克雷伯氏菌菌株来生产2,3-丁二醇的结果(图8：KO△ldhA，图9：KO△ldhA△budC，图10：KO△ldhA△dar，图11：KO△ldhA△budC△dar)。<本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基因，其特征在于，对具有乙偶姻与2,3‑丁二醇之间的转换活性的酶进行编码，并具有SEQ ID NO.12的碱基序列。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.09.27 KR 10-2013-01156821.一种基因，其特征在于，对具有乙偶姻与2,3-丁二醇之间的转换活性的
酶进行编码，并具有SEQIDNO.12的碱基序列。
2.根据权利要求1所述的重组载体，其特征在于，包含所述基因。
3.根据权利要求1所述的蛋白质，其特征在于，由所述基因进行编码。
4.根据权利要求3所述的蛋白质，其特征在于，具有SEQIDNO.11的氨
基酸序列。
5.一种重组微生物，其特征在于，权利要求3所述的蛋白质的活性受到抑
制。
6.一种2,3-丁二醇的生成能力得到增加的重组微生物，具有2,3-丁二醇及
乳酸生物合成途径，其特征在于，权利要求3所述的蛋白质的活性受到抑制。
7.根据权利要求6所述的重组微生物，其特征在于，将丙酮酸盐转换为乳
酸盐的途径也受到抑制。
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【专利技术属性】
技术研发人员：梁宅镐，宋孝鹤，朴钟明，切拉杜拉尔·拉斯纳西，
申请(专利权)人：GS加德士，
类型：发明
国别省市：韩国;KR