一种原人参二醇人体内代谢产物检测方法技术

本发明专利技术属药物分析学领域，涉及一种血浆或尿液样品中原人参二醇人体内代谢产物检测方法。本发明专利技术方法中，使用Agilent 1290超高效液相色谱仪串联AB 5600+Q TOF高分辨质谱仪，配ESI电喷雾离子源，色谱柱为Agilent Eclipse plus C18RRHD 1.8μm，2.1x 50mm，流动相为0.5％甲酸水溶液(A)、乙腈(B)梯度洗脱，流速0.3mL/min，柱温30℃,流动相梯度洗脱,洗脱过程为0-1min 95％A，1-1.5min 95％-75％A，1.5-6.0min 75%-25％A，6.0-12.0min 25％-0％A，12.0-13.0min 0％A，13.0-15.0 0％-95％A定性检测原人参二醇人体内代谢产物，通过与空白样品对比，识别未知代谢产物。所述方法具有高速、灵敏、高分辨率、高分离度等优点。

Method for detecting metabolism product of raw ginseng glycol in human body

The present invention belongs to the field of pharmaceutical analysis, and relates to a method for detecting metabolism products of ginseng glycol in human plasma or urine sample. In the method of the invention, the use of Agilent 1290 ultra performance liquid chromatography tandem AB 5600+Q TOF high resolution mass spectrometer with ESI electrospray ion source, the column was Agilent Eclipse plus C18RRHD 1.8 m, 2.1X 50mm, the mobile phase of 0.5% formic acid aqueous solution (A), acetonitrile (B) gradient elution, flow rate of 0.3mL/min, column temperature of 30 DEG C, mobile phase gradient elution, elution process of 0-1min 95%A, 1-1.5min 95%-75%A, 1.5-6.0min 75%-25%A, 6.0-12.0min 25%-0%A, 12.0-13.0min 0%A, 13.0-15.0 0%-95%A qualitative detection of protopanaxadiol in human metabolites, compared with the blank sample, the identification of unknown metabolites. The method has the advantages of high speed, sensitivity, high resolution, high separation, and the like.

【技术实现步骤摘要】
一种原人参二醇人体内代谢产物检测方法
本专利技术属于药物分析学领域，涉及一种液质联用检测方法，特别涉及一种血浆或尿液样品中原人参二醇人体内代谢产物检测方法。
技术介绍
现有技术公开了原人参二醇是原人参二醇型人参皂苷的体外水解产物，其结构属于达玛烷型四环三萜类人参皂苷元化合物，分子式为C30H52O3，分子量为460.70，熔点197.5-198.5摄氏度，研究表明该原人参二醇具有与人参皂苷相似的药理学活性，包括抗肿瘤作用、抑制癫痫发作、抗抑郁作用等。目前，原人参二醇作为一种抗抑郁的一类新药已经进入临床试验阶段，因此，研究其在人体内代谢过程为保证用药安全性和可靠性具有重要作用。实践显示，由于人参皂苷类物质响应较低，且人体用药剂量较小，血浆内源性相似原子质量的物质众多，故常规方法难以实现检测。超高效液相串联高分辨质谱技术是以超高效液相色谱为分离手段，以高分辨质谱为检测器的一种分离分析定性技术，其既具有超高效液相色谱的高分离能力，又具备高分辨质谱的高分辨率和高灵敏度的检测特点。因此，本申请的专利技术人拟建立一种基于超高效液相串联高分辨质谱联用的原人参二醇人体内代谢产物检测方法，以进一步用于人体内原人参二醇代谢产物的定性，为临床研究提供可靠分析手段。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种快速、准确、高分辨率、高灵敏度的原人参二醇人体内代谢产物检测方法。为实现上述目的，本专利技术通过下述技术方案施现:一种原人参二醇人体内代谢产物检测方法，其特征在于，其包括，使用Agilent1290超高效液相色谱仪串联AB5600+QTOF高分辨质谱仪质谱仪，配ESI电喷雾离子源，采样软件为AnalystTF1.51数据处理系统，分析软件为2.2、MasterViewTM1.1、MetabolitePilotTM1.0，色谱柱为AgilentEclipseplusC18RRHD1.8μm，2.1x50mm，流动相梯度洗脱，检测原人参二醇人体内代谢产物。本方法中，超高效液相色谱串联高分辨质谱可以实现短时间内充分分离多种未知物质，并根据精确分子量确定未知物分子式。本专利技术中，所述流动相为0.5％甲酸水溶液(A)、乙腈(B)梯度洗脱，流速0.3mL/min，柱温30℃；其中所述的甲酸可以提高阳离子模式下质谱的响应值；水和乙腈作为流动相可以对未知物实现全分离。本专利技术中，所述梯度洗脱过程为0-1min95％A，1-1.5min95％-75％A，1.5-6.0min75％-25％A，6.0-12.0min25％-0％A，12.0-13.0min0％A，13.0-15.00％-95％A；所述的梯度洗脱可以在最短时间内实现多种物质充分分离。本专利技术中，所述离子源为电喷雾电离源(ESI)，正离子扫描模式检测，扫描范围为10-1000Da，源温度为120℃，电离源气体1(N2)压力为50psi，电离源气体2(N2)压力为50psi，气帘气体(N2)压力为30psi，离子喷射电压为5500V，去簇电压(DP)为80V，CE为10eV；所述的质谱条件较温和，可以抑制代谢产物在源内裂解，减少假阳性结果。本专利技术中，待测物为临床试验最常用的临床样品，易获得，且能准确地反映药物在体内代谢的情况；本专利技术中优选待测物为血浆或尿液。本专利技术中，采用蛋白沉淀法进行待测物前处理；该蛋白沉淀法可以快捷有效地祛除血浆或尿液中的内源性干扰物质。本专利技术的原人参二醇人体内代谢产物检测方法具有如下优点：超高效液相色谱串联高分辨质谱兼具色谱的高分离度和质谱的高分辨率、高灵敏度的特点，进而能实现快速、准确地对样品中原人参二醇代谢产物的定性检测；色谱梯度洗脱条件能在短时间内实现多种未知物质的分离；蛋白沉淀法前处理待测物，能快速、高效、低成本地对血浆或尿液样品中的内源性干扰物质进行祛除，提高检测灵敏度。为了便于理解，以下将通过具体的附图和实施例对本专利技术进行详细地描述。需要特别指出的是，具体实例和附图仅是为了说明本专利技术的技术思想，显然本领域的普通技术人员可以根据本文说明，在本专利技术的范围内对本专利技术做出各种各样的修正和改变，这些修正和改变也纳入本专利技术的范围内。附图说明图1是人血浆中原人参二醇代谢产物检测色谱图，图中：(A)列为人口服原人参二醇100毫克后的血浆提取离子色谱图；(B)列为人口服原人参二醇前的空白血浆提取离子色谱图；TIC为总离子色谱图；原型药物标记为Parent；代谢产物为M1(m/z477)、M2(m/z491)、M3(m/z493)、M4(m/z495)、M6(m/z507)、M7(m/z509)。图2是人尿液中原人参二醇代谢产物检测色谱图，图中：(A)列为人口服原人参二醇100毫克后的尿液提取离子色谱图；(B)列为人口服原人参二醇前的空白尿液提取离子色谱图；TIC为总离子色谱图；代谢产物为M3(m/z493)、M5(m/z505)、M6(m/z507)、M7(m/z509)、M8(m/z523)M9(m/z525)。具体实施方式实施例1制定临床试验方案：包括确定试验对象和给药方案；试验对象：受试者为健康志愿者5名，其中男性3名，女性2名，平均年龄30岁；受试前30天及后15天内未使用任何药物和保健食品，尤其未使用含人参皂苷类药品和保健食品；试验者在试验开始前已充分告知受试者该试验的益处及风险，试验符合赫尔辛基宣言规范，并获得当地伦理委员会审批，双方签订知情同意书；给药方案：受试者于第-30天至第15天内停止服用一切药物及保健食品，清淡饮食，正常饮水；于第-7天至第-1天采集清洁中段尿液，每天采集合并后储存，每天采集量不低于50mL，该部分所得尿液作为给药前尿液空白对照；于第0天静脉采血20mL，离心后取血浆分装储存，该部分所得血浆作为给药前血浆空白对照；于第1天至第7天，每天早上服用优欣定胶囊1粒(每粒含PPD100mg)，随餐服用。于第1天至第7天采集清洁中段尿液，每天采集合并后储存，每天采集量不低于50mL，该部分所得尿液作为给药后尿液样品；于第5天早上服药后3小时静脉采血20mL，离心后取血浆分装储存，该部分所得血浆作为给药后血浆样品；临床样品的超高效液相色谱串联质谱分析：血浆样品预处理：静脉血样置于10ml玻璃离心管中(加肝素抗凝)，3500r/min离心5min分离血浆，取血浆500μl分装于冻存管中，-80℃超低温保存；检测时复融500μl血浆，加入1.5mL乙腈，涡旋90s混匀，于3000r/min离心10min；分取上清液500μl，在40℃加热块上加热，通氮气挥干，加60μl甲醇溶解，15000r/min高速离心10min，取上清液50μl装入进样瓶，5μl进UPLC-Q-TOF串联高分辨质谱定性分析；尿液样品预处理：取清洁中段尿置于50mL离心管中，3000r/min离心10min，取上清液分装于15mL离心管中，-80℃超低温保存。检测时复融尿液样品，取尿液1mL，加入1mL乙腈，涡旋90s混匀，于3000r/min离心10min；分取上清液100μl，在40℃加热块上加热，通氮气挥干，加60μl甲醇溶解，15000r/min高速离心10min，取上清液50μl装入进样瓶，5μl进UPLC-Q-TOF串联高分辨质谱定性分析；色本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种原人参二醇人体内代谢产物检测方法，其特征在于，使用Agilent1290超高效液相色谱仪串联AB 5600+Q TOF高分辨质谱仪质谱仪定性检测待测物中原人参二醇人体内代谢产物，其中包括，，配ESI电喷雾离子源，采用采样软件为Analyst TF 1.51数据处理系统，分析软件为

【技术特征摘要】
1.一种原人参二醇人体内代谢产物检测方法，其特征在于，使用Agilent1290超高效液相色谱仪串联AB5600+QTOF高分辨质谱仪质谱仪定性检测待测物中原人参二醇人体内代谢产物，其中包括，，配ESI电喷雾离子源，采用采样软件为AnalystTF1.51数据处理系统，分析软件为2.2、MasterViewTM1.1、MetabolitePilotTM1.0，色谱柱为AgilentEclipseplusC18RRHD1.8μm，2.1x50mm，流动相梯度洗脱。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述流动相梯度洗脱为0.5％甲酸水溶液(A)、乙腈(B)梯度洗脱，流速0.3mL/min，柱温30℃。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述梯度洗...

【专利技术属性】
技术研发人员：段更利，郁颖佳，凌今，龙佳坤，
申请(专利权)人：复旦大学，
类型：发明
国别省市：上海,31