一种iaaM基因表达载体及根系特异表达iaaM培育抗旱玉米的方法技术

本发明专利技术为一种iaaM基因表达载体及根系特异表达iaaM基因培育抗旱玉米的方法，所述载体包括启动子EXP18‑D和iaaM基因；该方法包括：构建iaaM基因表达载体、酶切反应验证目的基因iaaM、采用PCR从质粒上扩增的方法制备线性DNA、将线性DNA通过花粉管通道法转化入玉米自交系C92的基因组中的步骤；本发明专利技术通过根系特异启动子EXP18‑D，驱动生长素合成关键酶基因iaaM在玉米根系中特异性表达，促进根系生长发育，提高玉米的抗旱性。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于植物基因工程领域，具体涉及一种iaaM基因表达载体及通过在根系特异表达iaaM基因培育抗旱玉米的方法。
技术介绍
根系对植物的生长发育起着至关重要的作用，主要体现在从土壤中吸取水分和矿物元素，对植株起到固定支撑作用以及与其周围的多种微生物形成共生关系以提高植物的养分利用效率和抗逆性。在进化过程中，根系从根状茎等非常简单的结构逐渐进化成具有复杂结构的专门器官，这也体现了根系对植物的重要性。在某些情况下，对根系结构起调控作用的基因也能提高作物对氮、磷和水分的利用效率，从而增加产量，表明根系性状对增产的重要性。当较深层土壤中有可利用的水分时，根长得更长、扎得更深便是提升水分获取的一条有效途径。因此，植物根系的生长发育状况与抗旱性密切相关，总的来说，根系越发达、根冠比越大的植株的抗旱性能越强。植物激素是一类对根系结构起到主要调控作用的内源性因素，它们与环境刺激因素(比如水分、营养元素等的丰度)相结合来调节根的发育。其中，生长素和细胞分裂素是已知的参与根系发育调控的最主要的两种植物激素。在组培中，细胞分裂素与生长素的比值高低影响着植物器官的分化：通常比值高时，有利于芽的分化；比值低时，利于根的分化。在植物生长发育中，生长素对根分枝及不定根形成起正调控作用，当其含量升到一定浓度后会促进根的生长和分支。植物干旱应答的基因超过1000多个，选择哪类或哪个基因进行作物的抗旱改良一直是困扰科学界的一个难题，因此选择可以促进玉米根系生长发育，从而提高玉米的抗旱性，而又不影响正常有水分条件下玉米的产量的基因，并且控制该基因的特异性表达也是当前需要解决的重要课题之一。现有技术通常使用转录因子基因转化玉米，以获得抗旱转基因玉米。但是转录因子基因存在一定的缺陷，在增强抗旱的同时，往往带来较大的“副作用”，如导致植株变矮小。
技术实现思路
本专利技术的目的在于通过根系特异启动子驱动生长素合成酶关键基因iaaM，通过促进根系发育，促进玉米吸收土壤深层的水分，达到“根深叶茂”的目标。本专利技术的目的是通过以下技术方案实现的：一种iaaM基因表达载体，所述载体包括SEQIDNO.1所示的启动子EXP18-D和SEQIDNO.3所示iaaM基因。进一步的，利用PGM-35Sbar通用载体，启动子EXP18D在HindIII/SpeI位点替代UBQI启动子，筛选如SEQIDNO.2所示的标记基因CP4EPSP在载体SmaI/SacI之间替代标记Bar基因，目的基因iaaM位于SpeI/NotI酶切位点之间。进一步的，所述载体的构建方法包括以下步骤：1)PCR扩增水稻启动子EXP18D，将启动子EXP18D克隆至载体pMD18-T，得载体pMD18-T：EXP18D；2)从农杆菌中克隆生长素合成酶关键基因iaaM，将iaaM克隆至载体pMD18-T，得载体pMD18-T：iaaM；3)取表达载体pGreen029，限制性内切酶HindIII和SpeI酶切载体pGreen029，用同样的限制性内切酶HindIII和SpeI酶切载体pMD18-T：EXP18D，得到含HindIII和SpeI酶切位点的EXP18D片段；用T4DNA连接酶将表达载体pGreen029的酶切产物与EXP18D片段连接，得载体pGreen029：EXP18D；4)取载体pGreen029：EXP18D，限制性内切酶NotI和SpeI酶切载体pGreen029：EXP18D，用同样的限制性内切酶NotI和SpeI酶切载体pMD18-T：iaaM，得到含NotI和SpeI酶切位点的iaaM片段；用T4DNA连接酶将表达载体pGreen029：EXP18D的酶切产物与iaaM片段连接，得载体pGreen029：EXP18D：iaaM。一种iaaM基因表达载体的应用，所述载体包括SEQIDNO.1所示的启动子EXP18-D和SEQIDNO.3所示iaaM基因，通过根系特异启动子EXP18-D，驱动生长素合成关键酶基因iaaM在玉米根系中特异性表达，促进根系生长发育，提高玉米的抗旱性。一种通过在根系特异表达iaaM基因培育抗旱玉米的方法，包括以下步骤：1)构建iaaM基因表达载体，所述载体包括SEQIDNO.1所示的启动子EXP18-D和SEQIDNO.3所示iaaM基因；2)酶切反应验证目的基因iaaM；3)采用PCR从质粒上扩增的方法制备线性DNA；4)将线性DNA通过花粉管通道法转化入玉米自交系C92的基因组中；5)转基因后代的检测。本专利技术的有益效果：本专利技术采用来自单子叶植物水稻的根特异启动子EXP18-D来驱动生长素合成关键酶基因iaaM表达在玉米自交系中，促进了根系生长发育，增加在干旱条件下植株对深层土壤水分吸收，提高了转基因玉米的抗旱性，该方法对转基因玉米在正常有水分条件下的生长发育没有负面效应，就是说在干旱条件下能够提高转基因玉米产量，而水分充足条件下转基因玉米产量不减产，甚至还能增产，因为玉米根系发达能够增加各种营养离子的吸收。下面结合附图及具体实施方式对本专利技术作进一步详细说明。附图说明图1为载体pGreen029：EXP18D构建示意图；图2为载体pGreen029：EXP18D：iaaM构建示意图；图3为线性DNA片段pGreen029：EXP18D：iaaM示意图；图4为构建目的载体用内切酶SpeI/NotI酶切验证图片；图5为转基因株系目的基因iaaM的PCR扩增结果；图6为抗性植株标记基因35S-EPSP基因的PCR检测结构；图7为抗旱鉴定株系对照图片；图8为抗旱鉴定植株根系对照图片；图9为植株根长对照图片；图10为植株穗粒数和穗粒重对照图片。附图标记：图5中：M.DNA标准分子量；1：质粒，2：空白对照，3：非转基因植株，4-7为转基因植株：4：株系KHC92-1-5，5：株系KHC92-1-9，6：株系KHC92-1-12，7：株系KHC92-1-20。图6中：注：M:DL2000marker；1:空白对照；2：未转化植株；3-6：转基因植株:株系KHC92-1-5，KHC92-1-9，KHC92-1-12，KHC92-1-20。具体实施方式实施例1一种iaaM基因表达载体，所述载体包括SEQIDNO.1所示的启动子EXP18-D和SEQIDNO.3所示iaaM基因。利用实验室已构建PGM-35Sbar通用载体(王霄汉等安徽农业科学2012,40:12367-12370)，水稻根特异启动子EXP18D在HindIII/SpeI位点替代UBQI启动子，筛选如SEQIDNO.2所示的标记基因CP4EPSP在载体SmaI/SacI之间替代标记Bar基因，目的基因iaaM位于SpeI/NotI酶切位点之间，载体经测序验证正确。所述载体的构建方法包括以下步骤：1)PCR扩增水稻启动子EXP18D，将启动子EXP18D克隆至载体pMD18-T，得载体pMD18-T：EXP18D；2)从农杆菌中克隆生长素合成酶关键基因iaaM，将iaaM克隆至载体pMD18-T，得载体pMD18-T：iaaM；3)取表达载体pGreen029，限制性内切酶HindIII和SpeI酶切载体pGreen029，用同样的限制性内切酶HindIII和SpeI酶切本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种iaaM基因表达载体，其特征在于：所述载体包括SEQ ID NO. 1所示的启动子EXP18‑D和SEQ ID NO. 3所示iaaM基因。

【技术特征摘要】
1.一种iaaM基因表达载体，其特征在于：所述载体包括SEQIDNO.1所示的启动子EXP18-D和SEQIDNO.3所示iaaM基因。2.根据权利要求1所述的载体，其特征在于：利用PGM-35Sbar通用载体，启动子EXP18D在HindIII/SpeI位点替代UBQI启动子，筛选如SEQIDNO.2所示的标记基因CP4EPSP在载体SmaI/SacI之间替代标记Bar基因，目的基因iaaM位于SpeI/NotI酶切位点之间。3.根据权利要求1所述的载体，其特征在于：所述载体的构建方法包括以下步骤：1）PCR扩增水稻启动子EXP18D，将启动子EXP18D克隆至载体pMD18-T，得载体pMD18-T：EXP18D；2）从农杆菌中克隆生长素合成酶关键基因iaaM，将iaaM克隆至载体pMD18-T，得载体pMD18-T：iaaM；3）取表达载体pGreen029，限制性内切酶HindIII和SpeI酶切载体pGreen029，用同样的限制性内切酶HindIII和SpeI酶切载体pMD18-T：EXP18D，得到含HindIII和SpeI酶切位点的EXP18D片段；用T4DNA连接酶将表达载体pGreen029的酶切产物与EXP18D片段连接...

【专利技术属性】
技术研发人员：张中保，吴忠义，李向龙，张春，
申请(专利权)人：北京农业生物技术研究中心，
类型：发明
国别省市：北京;11