本发明专利技术涉及编码天冬氨酸激酶(EC:2.7.2.4；在下文中，称作LysC)、转酮醇酶(EC:2.2.1.1；在下文中，称作Tkt)或丙酮酸羧化酶(EC:6.4.1.1；在下文中，称作Pyc)的修饰的多核苷酸，其中起始密码子由ATG替代；包括其的载体；用所述载体转化的微生物；和利用其产生L-赖氨酸的方法。
【技术实现步骤摘要】
本申请是分案申请，原申请的申请日为2012年12月21日、申请号为201280070290.6、专利技术名称为“利用具有产生L-赖氨酸能力的微生物产生L-赖氨酸的方法”。专利技术背景1.专利
本专利技术涉及修饰的多核苷酸——其中起始密码子用ATG替代；包括其的载体；包括该多核苷酸的微生物；和利用其产生L-赖氨酸的方法。2.相关技术的描述棒状杆菌属的菌株,特别地谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumglutamicum)，是广泛地用于产生L-赖氨酸的革兰氏阳性微生物。L-赖氨酸用于动物饲料、人的药物和化妆品，并通过棒状杆菌菌株的发酵产生。常规地，具有提高的赖氨酸生物合成基因的棒状杆菌属的菌株和利用其产生L-赖氨酸的方法是已知的。例如，美国专利号6,746,855公开了通过培养具有增强的lysE基因(赖氨酸输出载体基因，lysineexportcarriergene)表达、并且另外引入选自dapA基因、lysC基因、pyc基因和dapB基因的基因的棒状杆菌而产生L-赖氨酸的方法。另一个方法是扩增关于赖氨酸生物合成途径的基因以修饰启动子。例如，韩国专利申请特许公开号2009-0082702和2009-0084099公开了通过将改进的ddh启动子和lysC-asd操纵子引入棒状杆菌而产生L-赖氨酸的方法。韩国专利申请特许公开号2008-0025355公开了通过增加染色体中关于赖氨酸生物合成途径的基因——其是aspB、lysC、asd、dapA、dapB、lysA和pyc——的拷贝数而提高赖氨酸生产力的方法。同时，由核糖体识别以启动染色体中翻译的起始密码子通常是ATG。翻译可根据基因的起始密码子而被控制，并且起始密码子的序列在蛋白质活性的调节中是重要的。然而，虽然ATG是源自谷氨酸棒状杆菌的赖氨酸生物合成基因中通常的起始密码子，但是lysC和pyc基因的起始密码子是GTG，并且TTG用于戊糖磷酸盐途径上的tkt基因，其含有起始密码子TTG(参考:J.Biotechnol.,104:5-本专利技术人已作出许多努力来找到提高赖氨酸生产力的方法，结果，他们发现野生型lysC、tkt和pyc基因的起始密码子可用ATG替代以提高天冬氨酸激酶、转酮醇酶和丙酮酸羧化酶相对于其内源活性的活性，由此完成本专利技术。专利技术概述本专利技术的目的是提供编码天冬氨酸激酶(EC:2.7.2.4；在下文中，称作LysC)、转酮醇酶(EC:2.2.1.1；在下文中，称作Tkt)或丙酮酸羧化酶(EC:6.4.1.1；在下文中，称作Pyc)的修饰的多核苷酸，其中多核苷酸的起始密码子用ATG替代。本专利技术的另一个目的是提供包括一种或多种编码天冬氨酸激酶、转酮醇酶或丙酮酸羧化酶的修饰的多核苷酸的载体，其中多核苷酸的起始密码子用ATG替代。本专利技术的另一个目的是提供微生物，其中一种或多种酶具有与它们的内源活性相比提高的活性。本专利技术的另一个目的是提供产生L-赖氨酸的方法，包括培养所述微生物，和从培养的微生物或培养肉汤回收L-赖氨酸的步骤。专利技术效果本专利技术提供具有提高的L-赖氨酸生产力的棒状杆菌属微生物，其中一种或多种编码天冬氨酸激酶、转酮醇酶或丙酮酸羧化酶的基因的起始密码子被替代，以与天然微生物中它们的内源活性相比提高相应的酶活性。优选实施方式的详细描述一方面，本专利技术提供编码天冬氨酸激酶(EC:2.7.2.4；在下文中，称作LysC)、转酮醇酶(EC:2.2.1.1；在下文中，称作Tkt)或丙酮酸羧化酶(EC:6.4.1.1；在下文中，称作Pyc)的修饰的多核苷酸，其中多核苷酸的起始密码子由ATG替代。每个编码天冬氨酸激酶、转酮醇酶或丙酮酸羧化酶的多核苷酸还可包括多核苷酸中的部分替代、缺失、插入或添加，只要它们中的每个具有酶活性，和基于已知的多核苷酸可具有70％或更多的同源性，特别地80％或更多的同源性，更特别地90％或更多的同源性，和更特别地95％或更多的同源性，和最特别地100％同源性。如本文所用，术语“同源性(同源的)”指野生型的lysC基因、tkt基因或pyc基因的核苷酸序列和其相应的修饰的基因，即，修饰的lysC基因、tkt基因或pyc基因的核苷酸序列——其中部分多核苷酸被替代、缺失、插入或添加——之间的相似性程度。如本文所用，术语“起始密码子”指当mRNA(信使RNA)的编码序列翻译成蛋白质时对应于翻译起始点的3个核苷酸。一般而言，微生物染色体中发现的起始密码子是ATG(mRNA上是AUG)、GTG(mRNA上是GUG)和TTG(mRNA上是UUG)，并且根据谷氨酸棒状杆菌的全部基因组序列的分析结果它们以62.5％～66.5％、23.1％～24.3％和10.3％～13.2％的比率存在(参考:HandbookofCorynebacteriumglutamicum,40p,LotharEggeling&MichaelBott,2005)。在迄今报道的源自棒状杆菌的赖氨酸生物合成基因当中，lysC和pyc具有起始密码子GTG，tkt具有起始密码子TTG。这些基因的起始密码子不是ATG，这被认为是棒状杆菌的独特特性。根据本专利技术的修饰的多核苷酸的特征在于lysC,tkt或pyc基因的起始密码子由ATG替代，并且这些具有这样替代的起始密码子的修饰的多核苷酸已首先被本专利技术人修饰。更详细地，在本专利技术中编码天冬氨酸激酶(LysC)或丙酮酸羧化酶(Pyc)的多核苷酸的GTG起始密码子由ATG替代，编码转酮醇酶(Tkt)的多核苷酸的TTG起始密码子由ATG替代。更具体地，lysC、tkt和pyc基因的序列分别是SEQIDNOs.13、14和15，具有的替代起始密码子为ATG的基因序列分别由SEQIDNOs.16、17和18表示。起始密码子的碱基替代可通过本领域已知的任何方法来进行，例如，位点专一诱变、同源重组，但不限于此。另一方面，本专利技术提供这样的载体，其包括编码天冬氨酸激酶、转酮醇酶或丙酮酸羧化酶的修饰的多核苷酸中的一种或多种修饰的多核苷酸，其中多核苷酸的起始密码子由ATG替代。具有的替代起始密码子为ATG并编码天冬氨酸激酶、转酮醇酶或丙酮酸羧化酶的修饰的多核苷酸——其可包含在本专利技术的载体中——可包括部分多核苷酸被替代、缺失、插入或添加的那些多核苷酸，只要它们具有酶活性，和可具有70％或更多的同源性,特别地80％或更多的同源性,更特别地90％或更多的同源性,更特别地95％或更多的同源性，和最特别地100％同源性。进一步，具有的替代起始密码子为ATG并编码天冬氨酸激酶、转酮醇酶或丙酮酸羧化酶的修饰的多核苷酸——其可包含在本专利技术的载体中——还可只包括部分的编码天冬氨酸激酶、转酮醇酶或丙酮酸羧化酶的基因，只要它们具有的替代起始密码子为ATG。如本文所用，术语“载体”指DNA构建物，其含有可操作地连接至合适的控制序列的碱基序列以在合适的宿主中表达靶基因。控制序列可包括启动转录的启动子、控制这种转录的某个操纵基因序列、编码mRNA上合适的核糖体结合位本文档来自技高网...
【技术保护点】
编码丙酮酸羧化酶(Pyc)的修饰的多核苷酸，其中所述多核苷酸的起始密码子由ATG替代。
【技术特征摘要】
2011.12.21 KR 10-2011-01395271.编码丙酮酸羧化酶(Pyc)的修饰的多核苷酸，其中所述多核苷酸的起始密码子由
ATG替代。
2.根据权利要求1所述的修饰的多核苷酸，其中所述编码丙酮酸羧化酶(Pyc)的
多核苷酸的所述起始密码子是GTG。
3.根据权利要求1所述的修饰的多核苷酸，其中所述修饰的多核苷酸由SEQID
NO.18的核苷酸序列表示。
4.包括根据权利要求1所述的修饰的多核苷酸的载体。
【专利技术属性】
技术研发人员：李光镐，林相曹，文准玉，张在佑，朴寿真，朴相喜，
申请(专利权)人：CJ第一制糖株式会社，
类型：发明
国别省市：韩国;KR
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