D(-)型2,3-丁二醇的生产率得到增强的重组微生物及利用其的D(-)型2,3-丁二醇的生产方法技术

本发明专利技术涉及具有使乙偶姻转化为2,3‑丁二醇的途径的微生物，并且涉及导入对使乙偶姻转化为D(‑)型2,3‑丁二醇的酶进行编码的基因的D(‑)型2,3‑丁二醇生产用重组微生物。并且，本发明专利技术涉及利用上述重组微生物生产D(‑)型2,3‑丁二醇的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及2,3-丁二醇的生产率得到增强的重组微生物及利用其的2,3-丁二醇的生产方法。
技术介绍
作为具有4个碳和2个羟基(-OH)的醇的一种(CH3CHOHCHOHCH3)的2,3-丁二醇，可化学性地催化转化为作为合成橡胶制备工序的原料物质的1,3-丁二烯(1,3-Butadiene)和用于燃料添加剂及溶剂的甲基乙基甲酮(Methylethylketone，MEK)。并且，2,3-丁二醇与汽油(Gasoline)相混合可适用于辛烷值增进剂(octanebooster)，来是在产业上极其重要的中间体。2,3-丁二醇可通过化学合成工序和微生物发酵工序进行生产。然而，通过上述工序的2,3-丁二醇的生产成本非常高，因此还未实现商业规模的2,3-丁二醇的生产。另一方面，近来，与通过微生物发酵工序的2,3-丁二醇生产技术的飞跃发展一同，随着化石燃料物质的价格的急剧上涨和国际性的对环境污染的限制，对于通过微生物发酵的生物基2,3-丁二醇的生产的关心和研究开发的重要性逐渐增大。2,3-丁二醇分子中包含两处的立体中心(stereocenter)，从而能够以3种立体异构体(stereoisomer)的形式存在，即，D(-)型(左旋体(levoform)、2R，3R–丁二醇(2R，3R-BDO))，L(+)型(右旋体(dextroform)、2S，3S-丁二醇(2S，3S-BDO))，内消旋型(meso)(2R，3S-丁二醇2R，3S-BDO)。除了上述提及的2,3-丁二醇的一般用途之外，具有光学活性的2,3-丁二醇能够以特殊用途使用。例如，D(-)型的2,3-丁二醇具有很低的冰点，来可用作抗冻剂(anti-freezeagent)，并且可用作医药品和农业用化学物的中间体。然而，通过化学合成工序来生产光学上纯的D(-)型2,3-丁二醇的方法，由于在合成及分离/精制方面耗费多而不优选，通过微生物发酵工序来生产光学上纯的D(-)型2,3-丁二醇的方法，在经济上有利(Zengetal.，Curr.Opin.Biotechnol.，22:1，2011)。可实现通过微生物发酵工序的生物基2,3-丁二醇的生产的微生物非常多样，具有代表性的为肠杆菌(Enterobacter)属、克雷伯氏菌(Klebsiella)属、芽孢杆菌(Bacillus)属、沙雷氏菌(Serratia)属等。存在于自然界中的野生型微生物存在如下问题：主要生产无光学活性的内消旋型2,3-丁二醇，或即使生产具有光学活性的2,3-丁二醇异构体，也以混合物的型进行生产。另一方面，多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa)能够以高纯度生产D(-)型2,3-丁二醇。然而，多粘类芽孢杆菌具有对高营养成分的要求非常高、且生产率及产量低，从而具有难以直接适用于当前的商业工序的问题。对此，本专利技术人以可适用于商业工序的水平来研究用于生产具有光学活性的D(-)型2,3-丁二醇的重组微生物中，确认了在特定基因的缺失/取代的重组微生物的情况下，以高生产率和产量来生产高纯度的D(-)型2,3-丁二醇，并完成了本专利技术。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题本专利技术的目的在于，提供D(-)型2,3-丁二醇的生产率得到增强的重组微生物及利用其的D(-)型2,3-丁二醇的生产方法。技术方案为了实现上述目的，本专利技术提供D(-)型2,3-丁二醇生产用重组微生物，具有将乙偶姻转化为2,3-丁二醇的途径，导入有用于对将乙偶姻转化为D(-)型2,3-丁二醇的酶进行编码的基因。并且，本专利技术提供D(-)型2,3-丁二醇的制备方法，包括：对本专利技术的重组微生物进行接种的步骤；以及对上述D(-)型2,3-丁二醇生产用重组微生物进行培养的步骤。有益效果本专利技术的重组微生物不仅D(-)型2,3-丁二醇的生产率高，而且通过调节导入的基因及抑制的基因，从而可调节所生产的2,3-丁二醇内的多个异构体的比率。附图说明图1表示在2,3-丁二醇生成菌株中各2,3-丁二醇异构体的生物合成途径。图2为对存在于作为基本菌株的产酸克雷伯氏菌内的与2,3-丁二醇的合成相关的基因操纵子进行图式化的图。图3为对存在于重组产酸克雷伯氏菌内的与2,3-丁二醇的合成相关的基因操纵子进行图式化的图。图4为当对多个重组克雷伯氏菌株进行分批发酵时，所生产的2,3-丁二醇异构体的气相色谱法(GC)分析结果。图5为当对重组克雷伯氏菌株(KoΔLB3)进行补料分批发酵时，各2,3-丁二醇异构体的生产结果。图6示出当对重组克雷伯氏菌株(KoΔLB3)进行补料分批发酵时，2,3-丁二醇异构体的纯度。具体实施方式本专利技术涉及D(-)型2,3-丁二醇生产用重组微生物，具有将乙偶姻转化为2,3-丁二醇的途径，导入有用于对将乙偶姻转化为D(-)型2,3-丁二醇的酶进行编码的基因。并且，本专利技术涉及D(-)型2,3-丁二醇的生产方法，包括：对本专利技术的重组微生物进行接种的步骤；以及对上述D(-)型2,3-丁二醇生产用重组微生物进行培养的步骤。以下，详细地说明本专利技术。本专利技术的重组微生物本专利技术的重组微生物为D(-)型2,3-丁二醇生产用重组微生物，上述D(-)型2,3-丁二醇生产用重组微生物具有将乙偶姻转化为2,3-丁二醇的途径，导入有用于对乙偶姻转化为D(-)型2,3-丁二醇的酶进行编码的基因。并且，可抑制用于对使将乙偶姻转化为内消旋型2,3-丁二醇的酶进行编码的一种以上基因。本专利技术的重组微生物可抑制用于将丙酮酸转化为乳酸的途径。优选地，本专利技术的重组微生物为由用于对将乙偶姻转化为内消旋型2,3-丁二醇的酶进行编码的基因被用于对将乙偶姻转化为D(-)型2,3-丁二醇的酶进行编码的基因取代而成。更优选地，本专利技术的重组微生物为如下重组微生物：用于对将乙偶姻转化为内消旋型2,3-丁二醇的酶(即，具有可将(R)-乙偶姻转化为内消旋型2,3-丁二醇的活性的酶)进行编码的基因被用于对将乙偶姻转化为D(-)型2,3-丁二醇的酶(即，具有用于将(R)-乙偶姻转化为D(-)型2,3-丁二醇的活性的酶)进行编码的基因取代，并且抑制用于将丙酮酸转化为乳酸的途径。上述具有用于将乙偶姻转化为2,3-丁二醇的途径的微生物可以为野生型微生物或重组微生物，并且可以为肠杆菌属、克雷伯氏菌属、芽孢杆菌属、沙雷氏菌属微生物等，优选为克雷伯氏菌属微生物，更优选为产酸克雷伯氏菌。优选地，本专利技术的重组微本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种D(‑)型2,3‑丁二醇生产用重组微生物，具有将乙偶姻转化为2,3‑丁二醇的途径，其特征在于，导入有用于对将乙偶姻转化为D(‑)型2,3‑丁二醇的酶进行编码的基因。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.12.16 KR 10-2013-01568021.一种D(-)型2,3-丁二醇生产用重组微生物，具有将乙偶姻转化为2,3-
丁二醇的途径，其特征在于，导入有用于对将乙偶姻转化为D(-)型2,3-丁二
醇的酶进行编码的基因。
2.根据权利要求1所述的D(-)型2,3-丁二醇生产用重组微生物，其特征
在于，所述用于对将乙偶姻转化为D(-)型2,3-丁二醇的酶进行编码的基因为
bdhPp。
3.根据权利要求1所述的D(-)型2,3-丁二醇生产用重组微生物，其特征
在于，所述用于对将乙偶姻转化为D(-)型2,3-丁二醇的酶进行编码的基因包
含SEQIDNO.21的碱基序列。
4.根据权利要求1所述的D(-)型2,3-丁二醇生产用重组微生物，其特征
在于，所述用于对将乙偶姻转化为D(-)型2,3-丁二醇的酶进行编码的基因为
对具有SEQIDNO.20的氨基酸序列的蛋白质进行编码的基因。
5.根据权利要求1所述的D(-)型2,3-丁二醇生产用重组微生物，其特征
在于，抑制用于对将乙偶姻转化为内消旋型2,3-丁二醇的酶进行编码的一种以上
的基因。
6.根据权利要求5所述的D(-)型2,3-丁二醇生产用重组微生物，其特征
在于，抑制budCKo或darKo。
7.根据权利要求5所述的D(-)型2,3-丁二醇生产用重组微生物，其特征
在于，抑制对具有SEQIDNO.9或SEQIDNO.11的氨基酸序列的蛋白质进行编
码的基因。
8.根据权利要求5所述的D(-)型2,3-丁二醇生产用重组微生物，其特征
在于，抑制具有SEQIDNO.10或SEQIDNO.12的碱基序列的基因。
9.根据权利要求1所述的D(-)型2,3-丁二醇生产用重组微生物，其特征
在于，所述微生物为克雷伯氏菌属。
10.根据权利要求1所述的D(-)型2,3-丁二醇生产用重组微生物，其特
征在于，抑制用于将丙酮酸转化为乳酸的途径。
11.一种D(-)型2,3-丁二醇的生产方法，其特征在于，包括：
对权利要求1至10中任一项所述的D(-)型2,3-丁二醇生产用重组微生物
进行接种的步骤；以及
对所述D(-)型2,3-丁二醇生产用重组微生物进行培养的...

【专利技术属性】
技术研发人员：梁宅镐，
申请(专利权)人：GS加德士，
类型：发明
国别省市：韩国;KR