一种敲除arcA提高克雷伯氏菌1,3-丙二醇产量的方法技术

本发明专利技术公开了一株克雷伯氏菌arcA基因缺失株的构建及应用。本发明专利技术利用同源重组的方法敲除产1,3‑丙二醇克雷伯氏菌抑制TCA循环的关键基因arcA，提高微氧条件下细胞的TCA循环活力，强化还原力再生，提高1,3‑丙二醇产量。敲除菌K.pneumoniaeΔarcA微氧条件下发酵甘油合成1,3‑丙二醇的产量提高12.57％，达到17.64g/L，表明敲除参与TCA循环转录调控的arcA基因能够有效提高1,3‑丙二醇产量。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术提供了一种敲除arcA基因提高克雷伯氏菌1,3-丙二醇产量的方法，属于代谢工程

技术介绍
1,3-丙二醇(简称PDO)是一种重要的化工原料，其主要用途是作为聚酯和聚氨酯材料合成的单体。目前，1,3-丙二醇的生产方法主要是化学合成法。由于化学合成法具有高污染、高能耗、高成本等缺点，人们将目光转移到具有绿色生产优势的生物法上。其中，克雷伯氏菌(Klebsiella)在微氧条件下发酵甘油合成PDO具有较高的底物转化率、开发价值及应用前景等优势。但细胞内的还原力供给一直是限制1,3-丙二醇生产的主要瓶颈。在微生物细胞中，TCA循环是胞内还原力的重要来源，但低溶氧条件会限制TCA循环活性，影响胞内还原力的再生。研究发现，大肠杆菌中双组分信号传导系统arcA-arcB能够感知外界氧含量变化并激活或抑制下游诸多酶的合成。当细胞从有氧环境转移到微氧环境下，arcB被磷酸化激活，其上磷酸基转移传递至arcA使其激活，进而抑制TCA循环活性。Klebsiella中也存在类似的arcA-arcB信号传导系统，调节细胞在不同溶氧条件下的生理代谢。基于此，本研究通过敲除Klebsiella双组分信号传导系统arcA-arcB中arcA基因，提高微氧条件下TCA循环活性，强化胞内还原力再生，从而提高1,3-丙二醇产量。
技术实现思路
本专利技术的目的是通过敲除arcA基因强化TCA循环，进而提高胞内氧化还原水平，有利于微氧条件下产物1,3-丙二醇的合成。
技术实现思路
简单易操作，可广泛应用Klebsiella属各种菌株，以下以肺炎克雷伯氏菌(K.pneumoniae)为例具体工艺步骤包括工艺1、2、3：工艺1：利用Red重组系统敲除控制微氧条件下TCA循环通量的arcA基因。A以pKD13质粒为模板，设计引物构建出需敲除基因的打靶片段。B将A中所克隆出的打靶片段电转入K.pneumoniae(含氯霉素抗性的pKD46质粒)感受态中，并涂布卡那霉素抗性平板，PCR验证筛选出阳性克隆。C消除所得阳性克隆中pKD46质粒，然后电转入pCP20质粒，以消除菌株卡那霉素抗性标记，并通过PCR验证突变株，此菌株即为arcA基因缺失的K.pneumoniae。D高温条件下，通过连续传代消除arcA缺失株中的pCP20质粒。工艺2：利用qRT-PCR分析arcA基因敲除后TCA循环基因转录水平的变化，包括以下步骤：A提取K.pneumoniae及K.pneumoniaeΔarcA总RNA。B去除总RNA中的基因组DNA。C以总RNA作模板反转录合成cDNA。D内参基因选用K.pneumoniae的16SrRNA基因，根据NCBI公布的16SrRNA、icd、gltA、sucC、sdhC的基因序列设计引物并合成。E利用qRT-PCR扩增，分析基因转录水平变化。工艺3：重组菌在微氧条件下代谢甘油合成1,3-丙二醇。A种子液培养：挑取单菌落接种于液体LB培养基，37℃、100r·min-1培养16h。按0.5％(v/v)的接种量转接到50mL的液体LB培养基，培养至OD600＝3。B摇瓶发酵培养：按4％(v/v)的接种量转接至发酵培养基，37℃，100r·min-1培养72h。本专利技术的有益效果：现有技术主要涉及副产物途径基因的敲除，使碳流转向1,3-丙二醇的合成。而本专利改造的特殊性在于，解除TCA循环在微氧环境下的转录调控，强化了1,3-丙二醇的积累，此前文献中未有报道在Klebsiella中敲除arcA基因提高1,3-丙二醇的产量。实施例发酵结果表明，构建的K.pneumoniaeΔarcA具有更高的1,3-丙二醇合成能力，产量提高12.57％。附图说明图1arcA基因敲除突变株菌落PCR示意图。图2arcA突变株中TCA循环关键酶基因icd、gltA、sucC、sdhC转录水平与野生菌相比的变化。图3野生菌及突变株的生物量变化示意图。图4野生菌及突变株的代谢产物变化示意图。具体实施方式下面通过实施例对本专利技术进一步说明。实例1本实施例说明利用Red重组技术敲除K.pneumoniae中arcA基因的方法1K.pneumoniae接种于液体LB培养基，37℃培养至OD600＝0.6，制备电转化感受态。2将含有氯霉素抗性的pKD46质粒导入K.pneumoniae感受态，30℃培养12h，转接至液体LB培养基(含氯霉素30μg·L-1)，30℃培养至OD600＝0.25，加入30mM阿拉伯糖，37℃下诱导pKD46质粒表达Exo、Bet和Gam三个蛋白，再次制备K.pneumonia(pKD46)感受态。3以卡那霉素抗性的pKD13质粒作模板，设计两端带有arcA同源片段的扩增引物，扩增获得线性DNA片段。引物序列如下：上游引物序列为：GGACTTTGGTACTTCCTGTTTCGATTTAGTTGGCAATTTAGGTAGCAAACGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC下游引物序列为：ACGGCGCCCTGAGGCGCCGTTTTCACATCATGGCTGCGGAATAAAACGCACTGTCAAACATGAGAATTAA以pKD13作模板进行PCR反应，反应条件：95℃变性5min，经94℃30s，52℃30s，72℃1.5min，30个循环，再经过72℃延伸10min，降温至20℃，加入适量核酸内切酶DpnI(购自Takara)去除模板，获得arcA基因敲除盒。4电转化线性DNA片段(含有卡那霉素抗性基因)至K.pneumoniae感受态(含有pKD46质粒)，并涂布于含有卡那霉素的LB平板筛选阳性重组子，并进行PCR鉴定，获得阳性克隆。5以上述阳性克隆制备电转感受态，导入能够诱导表达FLP重组酶(FLP是一个单体蛋白，在质粒pCP20中高温诱导表达，该蛋白表达后，可以消除由质粒pKD13引入的外源基因)的质粒pCP20，42℃下诱导表达FLP重组酶，消除上述引入的卡那霉素抗性基因。6以K.pneumoniae及K.pneumoniaeΔarcA基因组作为模板PCR验证，结果见说明书附图中图1所示，泳道1所示PCR条带在1100bp左右，泳道2所示条带在600bp左右，与理论条带一致，表明arcA缺失株构建成功。实例2arcA基因敲除后微氧条件下TCA循环关键基因转录水平变化。1K.pneumoniae总RNA的提取(1)将收集的新鲜菌体立即在液氮中研磨。(2)加入1mLTRIzon，使菌体充分裂解，室温放置5min，分离蛋白核酸复合物。(3)向上步骤溶液中加入0.2mL氯仿，盖好管盖，剧烈振荡15s，室温放置3min。(4)4℃，12000r·min-1离心15min，将上层水相转移到新的无RNase的离心管中。(5)加入等体积异丙醇，吹打均匀，室温放置10min。(6)4℃，12000r·min-1离心10min，弃除上清。(7)加入1mL无RNase的75％乙醇洗涤沉淀。(8)4℃，12000r·min-1离心3min，弃除上清。(9)室温放置至乙醇挥发完全，加入30μL无RNase水溶解，于-70℃保存。2引物的设计与合成内参基因选用K.pneumonia(GenBankAccessionNo.NC_011283本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种敲除arcA基因提高克雷伯氏菌1,3‑丙二醇产量的方法，其特征在于，是将克雷伯氏菌属(Klebsiella)细菌的TCA循环抑制蛋白基因(arcA)敲除实现微氧条件下TCA循环的正常运作，得到可实现微氧条件下1,3‑丙二醇高效积累的产1,3‑丙二醇克雷伯氏菌基因工程菌。

【技术特征摘要】
1.一种敲除arcA基因提高克雷伯氏菌1,3-丙二醇产量的方法，其特征在于，是将克雷伯氏菌属(Klebsiella)细菌的TCA循环抑制蛋白基因(arcA)敲除实现微氧条件下TCA循环的正常运作，得到可实现微氧条件下1,3-丙二醇高效积累的产1,3-丙二醇克雷伯氏菌基因工程菌。2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于，利用Red重组系统敲除了对于TCA循环有重要调控作用的arcA基因，包括以下步骤：A.以pKD13为模板，设计引...

【专利技术属性】
技术研发人员：诸葛斌，陆竞争，陆信曜，宗红，宋健，任顺利，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32