云南疣粒野生稻MeXB3基因及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种云南疣粒野生稻MeXB3基因及其应用，属于分子生物学技术领域。云南疣粒野生稻MeXB3基因，其cDNA序列是SEQ ID NO.1所示的DNA序列，由云南疣粒野生稻中克隆和鉴定。编码云南疣粒野生稻MeXB3基因，由EQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成。云南疣粒野生稻MeXB3基因在抗水稻白叶枯病中的应用。本发明专利技术的有益效果在于：克隆并鉴定了云南疣粒野生稻的MeXB3基因，并获得转MeXB3基因植株。该基因在疣粒野生稻中属于诱导型表达，对获得的转基因材料进行鉴定后发现，该基因能增强水稻对部分白叶枯病菌小种的抗性，从而提高水稻抗白叶枯病能力，为水稻抗病育种提供基因资源，对培育高抗白叶枯病水稻具有重要的理论及实际意义。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种云南疣粒野生稻MeXB3基因及其应用，属于分子生物学

技术介绍
由革兰氏阴性菌黄单孢水稻变种(Xanthomonasoryzaepv.oryzae,Xoo)引起的细菌性病害是严重的全球性水稻病害之一。水稻是亚洲许多国家的主要粮食，因此水稻白叶枯病对亚洲国家粮食生产的威胁尤为严重(Singhetal.2001),该病害也严重影响了我国水稻的高产、稳产，在发病较重的年份和地区该病可使水稻减产50％甚至绝收(章琦等，2007)。过量使用化学药物防治白叶枯病可能导致环境破坏，选育带有主效抗病基因的品种才是控制水稻白叶枯病行之有效的方法。但是由于白叶枯病菌生理小种变异频繁，新的抗性品种在使用几年后抗性下降或消失(Hulbertetal.2001)。因此，不断挖掘利用显得抗病基因资源，研究相关抗病机理，提升和延展抗病基因功能，已成为水稻抗病育种的重要研究内容。在长期的自然选择下，野生稻对环境的适应性远远高于栽培稻，具很多优良性状，如抗病、抗虫、耐旱等。因此，野生稻已成为水稻育种中基因资源发掘的宝库。云南疣粒野生稻(OryzameyerianaBaill)具有较强的抗逆性，特别是高抗甚至是免疫白叶枯病(钱韦等，2001)，在稻属植物中表现突出，已成为抗病育种的重要种质资源，但云南疣粒野生稻的抗病机理还不清楚。目前已发掘的水稻白叶枯病抗性基因共38个，其中7个来自于野生稻，即来自于普通野生稻的Xa21、Xa23、Xa30(Songetal.1995；Zhangetal.1996；Jinetal.2007)，小粒野生稻Xa27(Wuetal.2008)，药用野生稻Xa29(Tanetal.2004)，澳洲野生稻Xa32(苗丽丽等，2010)，仅有一个隐性基因xa32来源于疣粒野生稻的(阮辉辉等，2008)。但xa32基因为隐性，且与SSR标记距离较远，使得该基因很难被用于水稻育种。因此，从云南疣粒野生稻中发掘新的抗病基因资源，已成为疣粒野生稻研究的重要内容。本专利技术所述的云南疣粒野生稻抗白叶枯病基因MeXB3属于蛋白泛素化降解过程的关键酶之一的E3泛素连接酶(ubiquitinligase，E3)的编码基因，是水稻XB3基因的同源基因，与XBOS31(LOC4324295)有60％相似性。E3是一个超大的蛋白家族，可以分为HECT(homologoustotheE6-APcarboxylterminus)型、RING(ReallyInterestingNewGene)/U-box型、Cullin-RING型、APC/C型等(VierstraRDetal.2009；Smalleetal.2004)。其中Ring型的E3的编码基因可以根据亚结构域分为30个亚家族，这些亚结构域包括BRCT、Ankyrin重复和vWA结构域(WendyJetal.2012)。XB3基因是一个含有RING指结构域(RingFingerDomain，RING)和锚蛋白重复序列区(AnkyrinRepeatDomain,ANKY)的泛素连接酶E3。水稻XB3基因所编码的蛋白是广谱抗病基因Xa21的锚定蛋白，XB3基因的缺失突变体中，Xa21水稻对白叶枯病的抗性降低。此外，XB3的表达量减少也导致了Xa21蛋白含量的减少。说明XB3对于Xa21的累积是必须的而且和Xa21调节的抗性相关(Wangetal.2006；Chengetal.2010)。目前还未见疣粒野生稻XB3基因研究的公开报道。因此，专利技术将为水稻抗病育种提供新的基因资源，为研究云南疣粒野生稻抗病机理奠定基础。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服云南疣粒野生稻基因发掘的不足，而提供一种云南疣粒野生稻MeXB3基因及其应用。本专利技术的技术方案如下：云南疣粒野生稻的MeXB3基因，其全长cDNA序列是SEQIDNO.1所示的DNA序列。MeXB3基因全长cDNA序列长2133bp(碱基对)，编码437个氨基酸组成的蛋白，其氨基酸序列是SEQIDNO.2所示的氨基酸序列。本专利技术将云南疣粒野生稻MeXB3基因转入水稻，在抗水稻白叶枯病中的应用，本专利技术的有益效果为：本专利技术首次克隆并鉴定了云南疣粒野生稻的MeXB3基因，并获得转MeXB3基因植株。该基因在疣粒野生稻中属于诱导型表达，对获得的转基因材料进行鉴定后发现，该基因能增强水稻对部分白叶枯病菌小种的抗性，从而提高水稻抗白叶枯病能力，为水稻抗病育种提供基因资源，对培育高抗白叶枯病水稻具有重要的理论及实际意义。附图说明图1.qRT-PCR法进行MeXB3基因表达谱。图2.MeXB3基因结构图。MeXB3基因具N端和C端分别有1个跨膜结构域，含有5个Ankryin保守结构域、1个Ring保守结构域。图3.转MeXB3基因水稻植株的PCR检测。图4.转MeXB3基因水稻植株抗白叶枯病的抗病性鉴定。具体实施方式下面结合具体实施实例，进一步阐述本专利技术。各实施例中无特殊说明的均为常规方法。试验材料：云南疣粒野生稻(OryzameyerianaBaill)，白叶枯病病原菌Y8，白叶枯病病原菌Y8为云南省典型的白叶枯病致病菌株，该菌株使用是利用其对水稻的侵染能力的共性从而导致水稻叶片形成白叶枯病病斑，因此，使用其它具有同样致病能力的各种白叶枯病菌菌株都能达到本专利技术的效果。以下各实施例所用试剂均为市售。实施例1云南疣粒野生稻抗白叶枯病相关基因MeXB3的克隆及分析(1)材料的培养及处理云南疣粒野生稻(OryzameyerianaBaill)栽于温室内，直至开花期。用NA培养基活化白叶枯病病原菌Y8，28℃培养2-3d，用无菌蒸馏水洗下菌苔，配制成OD600为0.6的菌液。在温室温度升至28℃时以剪叶法接种云南疣粒野生稻叶片，对照组用无菌水模拟接种，接菌后分别于2h、4h、8h、24h、48h、72h等量取样，对照即无菌水剪叶的云南疣粒野生稻也同时等量取样，取样后立即把样品放入液氮中速冻，并放-80℃冰箱中保存备用。(2)总RNA的提取、定量及检测分别取接菌后2h、4h、8h、24h、48h、72h的云南疣粒野生稻叶片100mg采用E.Z.N.A.PlantRNAKit(美国OMEGA公司)试剂盒提取总RNA，操作方法按公司提供的试剂盒说明书进行。抽提完后，取0.5μL总RNA用Nanodrop2000分光光度计(美国ThermoFisherScientific公司)测定总RNA浓度，并用OD260/OD280的比值确认RNA纯度。取3μl总RNA在1％琼脂糖凝胶上分离总RNA，检测总RNA的完整性。(3)RealtimePCR(qRT-PCR)法分析MeXB3基因表达普取接菌后不同时间的1ug总RNA做反转录合成cDNA第一链，具体方法按照PrimeScriptTMRTreagentKitwithgDNAEraser反转录试剂盒(宝生物工程大连有限公司)说明书操作。根据MeXB3的EST序列设计qRT-PCR扩增引物，以水稻β-Actin基因作为内参基因，按照PremixExTaqTMII试剂盒(宝生物工程大连有限公司)进行qRT-PCR扩增，分析云南疣粒野生稻受白叶枯病菌胁迫后不同时期的表达情况。MeXB3的EST序列上游引物本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种云南疣粒野生稻MeXB3基因，其特征在于其cDNA由SEQ ID NO.1所示的DNA序列组成。

【技术特征摘要】
1.一种云南疣粒野生稻MeXB3基因，其特征在于其cDNA由SEQIDNO.1所示的DNA序列组成。2.编码云南疣粒野生稻MeXB3...

【专利技术属性】
技术研发人员：付坚，程在全，王波，李定琴，钟巧芳，王玲仙，陈玲，殷富有，陈越，张敦宇，柯学，杨雅云，肖素勤，曾民，黄兴奇，
申请(专利权)人：云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所，
类型：发明
国别省市：云南;53