本发明专利技术提供一种药用野生稻基因OobZIP2及其表达载体和构建方法，具体地，该药用野生稻基因OobZIP2的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，该基因编码的氨基酸序列如SEQ ID No.16所示。该野生稻基因OobZIP2具有完整CDS区，且上调基因表达显著，它们属于bZIP家庭的G亚族；该OobZIP2具有转录激活活性；该OobZIP2获得的转基因植株中OobZIP2表达量显著增高，具有抗盐和抗旱的抗逆性。
【技术实现步骤摘要】
一种药用野生稻基因OobZIP2及其表达载体和构建方法
本专利技术涉及水稻基因工程领域，具体涉及一种药用野生稻基因OobZIP2及其表达载体和构建方法。
技术介绍
水稻是世界上最重要的粮食作物之一，也是我国的第一大粮食作物。非生物胁迫如干旱等会严重影响水稻的生长发育及产量。在稻属(Oryza)中，仅有亚洲栽培稻(O.sativaL.)和非洲栽培稻(O.glaberrimaSteud)2个为栽培种，其余20余种均为野生稻，由于长期在野生状态下生长，经过抵御病虫害的侵袭和不良环境的自然选择，野生稻蕴含了大量的优良基因，是一个天然的基因宝库(鄂志国等，遗传，2008(11):1397-1405.，2008)。但因其与栽培稻(AA染色体组)之间存在严重的生殖障碍，其有利性状目前未得以高效利用。bZIP(BasicLeucinzipper)转录因子即碱性亮氨酸拉链蛋白，它广泛存在于动物、植物、微生物当中，是一类结构较为保守的转录调控因子。目前，水稻bZIP转录因子家族成员中，有OoABI5(Zouetal.,2008)、OsbZIP23(Xiangetal.,2008)、OsbZIP72(Luetal.,2009)、OoABF1(Hossainetal.,2010)、OoABF2(Hossainetal.,2010)、OsbZIP60(喻旭等，2011)、OsbZIP46(Tangetal.,2012)、OsbZIP39(Takahashietal.,2012)、OsbZIP52(Liuetal.,2012)、OsbZIP58(Wangetal.,2013)、OsbZIP71(Liuetal.,2014)等被成功克隆，且对干旱、高盐、高温、低温以及其他生物胁迫表现出良好的抗性。因此，针对药用野生稻中bZIP转录因子家族基因的研究，以及将有利性状的基因介导入栽培稻，对获得具有优良性状的栽培稻植株具有重要意义。
技术实现思路
为了克服现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种与栽培稻具有较高同源性、能有效提高抗逆性的药用野生稻基因OobZIP2。为解决上述问题，本专利技术所采用的技术方案如下：一种药用野生稻基因OobZIP2，该基因的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。作为优选，上述的药用野生稻基因OobZIP2，通过以下步骤制得：1)提取药用野生稻RNA；2)合成cDNA第一链；3)PCR扩增：以cDNA第一链为模板，采用如SEQIDNo.2所示的上游引物以及如SEQIDNo.3所示的下游引物，进行PCR扩增，获得目的基因条带，电泳切胶回收。作为优选，上述药用野生稻基因OobZIP2，所述步骤3)中，采用50μL反应体系：10×PCRBufferforKOD-Plus-Neo5μL；2mMdNTPs5μL；25mMMgSO43μL；上游引物(10μM)1.5μL，下游引物(10μM)1.5μL；模板5μL；KOD-Plus-Neo(1U·μL-1)1μL；ddH2O28μL；其中所述模板为cDNA第一链；PCR反应程序为：94℃预变性2min；循环(98℃，10sec；68℃，1min)40次；最后72℃延伸5min。本专利技术的目的之二在于提供上述药用野生稻基因OobZIP2的表达载体的构建方法，包括以下步骤：a)PCR扩增：以该基因的重组质粒为模板，采用如SEQIDNo.4的上游引物以及如SEQIDNo.5所示的下游引物，进行PCR扩增，电泳切胶回收；b)双酶切：用SacI和NotI对步骤a)得到的切胶回收产物进行双酶切，切胶回收后得到酶切基因片段；c)连接：用SacI和NotI对质粒pet32a(+)进行双酶切，切胶回收后，与步骤b)得到的酶切基因片段进行连接，得到重组原核表达载体pet32a-OobZIP2。本专利技术的目的之三在于提供上述的药用野生稻基因OobZIP2的另一表达载体的构建方法，所述表达载体为超表达载体，包括以下步骤：a)PCR扩增：以该基因的重组质粒为模板，以如SEQIDNo.6所示的上游引物和如SEQIDNo.7所示的下游引物，进行PCR扩增，电泳切胶回收；b)双酶切：用SmaI和XbaI对步骤b)得到的切胶回收产物进行双酶切，切胶回收后得到酶切基因片段；c)连接：用SmaI和XbaI对质粒pGBKT7进行双酶切，切胶回收后，与步骤b)得到的酶切基因片段进行连接，得到表达载体pGBKT7-OobZIP2。本专利技术的目的之四在于提供一种氨基酸序列，该氨基酸由上述的药用野生稻基因OobZIP2编码，所述氨基酸序列如SEQIDNo.16所示。本专利技术的目的之五在于提供上述的药用野生稻基因OobZIP2在增强水稻抗逆性中的应用。本专利技术的目的之六在于提供上一种转基因植株的制备方法，由上述表述载体转化农杆菌感受态细胞，并介导入成熟愈伤组织培养得转基因植株。相比现有技术，本专利技术的有益效果在于：1.本专利技术同时提供了一种药用野生稻基因OobZIP2，是通过药用野生稻RNA扩增而得；经同源性基因比对，该药用野生稻基因OobZIP2具有完整CDS区，且上调基因表达显著，进化树分析表明，它们属于bZIP家庭的G亚族；2.本专利技术提供的药用野生稻基因OobZIP2，经转化重组质粒pGBKT7-OobZIP2的酵母菌株，在单缺(SD/-Trp)和三缺(SD/-Trp/-His/-Ade)培养基上均能正常生长且在β-半乳糖苷酶显色反应中均显示蓝色，而转化空载体pGBKT7的酵母菌株只能在单缺(SD/-Trp)培养基上生长且β-半乳糖苷酶显色反应中不显色，说明OobZIP2激活了下游报告基因Trp、His、Ade和LacZ的表达，具有转录激活活性；3.采用pCAMBIA1301载体构建表达载体，通过根癌农杆菌介导法将其导入水稻品种日本晴，并获得转基因植株，经qRT-PCR验证，T1转基因植株中OobZIP2表达量显著增高；该转基因植株在高盐和20％PEG6000胁迫下均比日本晴长势好，说明OobZIP2提高转基因植株的抗逆性。下面结合附图和具体实施方式对本专利技术作进一步详细说明。附图说明图1为OobZIP2分别在四叶期和抽穗期药用野生稻中的表达模式分析，其中c为四叶期，d为抽穗期；图2为OobZIP2与栽培稻同源基因氨基酸序列比对情况；图3为重组原核表达载体pet-32a-OobZIP2PCR检测图，其中M泳道为marker，2泳道为重组原核表达载体pet-32a-OobZIP2；图4为重组原核表达载体pet-32a-OobZIP2酶切图，其中M泳道为marker，3泳道为酶切后重组原核表达载体pet-32a-OobZIP2；4泳道为未酶切重组质粒pet-32a-OobZIP2；图5为重组超表达载体pCAMBIA1301-OobZIP2PCR检测图，其中M泳道为marker，1泳道为阴性对照，15-18泳道为重组超表达载体pCAMBIA1301-OobZIP2；图6为重组超表达载体pCAMBIA1301-OobZIP2酶切图，其中M泳道为marker，4泳道为酶切后重组超表达载体pCAMBIA1301-OobZIP2；5泳道为未酶切重组超表达载体pCAMBIA1301-OobZIP2；6泳道为OobZIP2目的基因CDS；图7为转O本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种药用野生稻基因OobZIP2，其特征在于，该基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
【技术特征摘要】
1.一种药用野生稻基因OobZIP2，其特征在于，该基因编码的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。2.如权利要求1所述的药用野生稻基因OobZIP2的表达载体的构建方法，包括以下步骤：a）PCR扩增：以该基因的重组质粒为模板，采用如SEQIDNo.4的上游引物以及如SEQIDNo.5所示的下游引物，进行PCR扩增，电泳切胶回收；b）双酶切：用SacI和NotI对步骤a）得到的切胶回收产物进行双酶切，切胶回收后得到酶切基因片段；c）连接：用SacI和NotI对质粒pet32a(+)进行双酶切，切胶回收后，与步骤b）得到的酶切基因片段进行连接，得到重组原核表达载体pet32a-OobZIP2。3.如权利要求2所述的表达载体。4.如权利要求1所述的药用野生稻基因OobZIP2的表...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈志雄，戴双凤，刘向东，谭碧兰，谢海媚，夏昌选，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：广东;44
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