猪瘟病毒感染性cDNA载体的制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种猪瘟病毒感染性ｃＤＮＡ载体的制备方法和应用，该载体含有Ｔ７启动子和猪瘟病毒标准强毒石门株基因组的ｃＤＮＡ，在Ｔ７启动子下游的ｃＤＮＡ中，缺失ＮＳ２基因中的１２６０个碱基对，保留５’端第３７５２碱基对至ＰｓｈＡＩ位点第３８８１碱基对之间１３０ｂｐ的ＮＳ２基因片段，其余ｃＤＮＡ序列与石门株感染性克隆ｃＤＮＡ相同。本发明专利技术方法简单，操作方便，可构建双价或多价基因工程疫苗，适合猪瘟病毒的鉴别诊断和疫苗的研究中的应用。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于基因工程
，具体地说，本专利技术涉及一种猪瘟病毒感染性cDNA载体的制备方法，载体表达产生的病毒以及其在猪瘟病毒的鉴别诊断和疫苗研究中的应用。
技术介绍
猪瘟是猪的一种最重要的急性、接触性传染病，死亡率高达90％以上。国际兽疫局制定的《国际动物卫生法典》中，猪瘟被列入16种法定传染病之一。我国是猪瘟的高发国，猪瘟频繁的爆发流行给养猪业造成了巨大的经济损失，严重阻碍了我国畜牧业的发展和出口贸易。猪瘟在世界范围内广泛流行，南美、欧洲和远东的一些国家和地区尤为严重。猪瘟流行的特点是具有高度接触传染性，流行广泛，发病率、死亡率高，危害极大。猪体间的直接接触是CSFV传播的重要途径，病猪的迁移、猪肉和猪肉制品的流通以及人群活动可能是导致猪瘟大面积流行的重要原因。此外，CSFV可在野猪和山羊中传播，吸血节肢动物在一定条件下也会传播CSFV。50年代我国研制出的猪瘟兔化弱毒疫苗应用后，猪瘟在全球的急性发生和大流行得到了有效的控制。但上世纪70年代后期，我国猪瘟的流行又重新抬头，并在形式上发生了很大的变化(Artois et al，2002)从频发的大流行转为无规律的散发流行，流行速度缓慢，疫点显著减少，病程由急性转为慢性，临床症状由典型变为非典型，病原毒力降低，出现持续感染、胎盘感染、母猪繁殖障碍等(Elber et al，1999；Carrascol et al，2001；Gomez-villamandos et al，2003)。增加免疫剂量和免疫次数，也不能控制猪瘟的发生，而且呈蔓延的趋势。因此，研制新一代疫苗已成当务之急。自猪瘟发生后，人们一直在寻找其致病机制，但直到现在关于猪瘟病毒致病机制的研究仍进展缓慢，其原因很大一部分归因于缺少合适的细胞研究模型，而缺少细胞研究模型的直接原因则是由于猪瘟病毒进行离体细胞培养时一般不产生致细胞病变效应(cytopathic effect，CPE)。最近国外从自然界中分离到3株致细胞病变型(cp型)CSFV毒株。已有研究表明，cp型瘟病毒其实是一对病毒的混合物，由非致细胞病变(ncp型)的野生病毒与干扰缺损颗粒组成，其中干扰缺损颗粒具有典型的亚基因组结构，缺失了从Npro到NS2的整个编码区域，实验证明这样的DI颗粒能引起宿主细胞产生CPE的特性是可以遗传的。进一步的研究发现，野生型CSFV非结构蛋白NS2和NS3以二联体形式存在，而在干扰颗粒中，NS2基因连同上游的全部编码区被缺失，二联体变成NS3单体，故认为致细胞病变型猪瘟病毒NS3蛋白单体的过量表达是细胞产生CPE的标志。为了构建新一代猪瘟疫苗，张楚瑜等在完成了具有我国自主知识产权的三株病毒即猪瘟病毒标准强毒石门株，兔化弱毒疫苗株(C strain)和低毒株39基因组全序列后，又成功构建了猪瘟病毒标准强毒石门株的全基因组感染性cDNA克隆(吴海祥，张楚瑜等，2003年4月 科学通报第8期)，但是这种全基因组感染性cDNA克隆表达产生的是干扰缺损颗粒，这种干扰缺损颗粒并不能单独引起实验动物产生病变，并引起动物产生免疫反应，它必须要有辅助病毒才能致细胞病变。更重要的是，它不能直接作灭活病毒疫苗应用，也不能作减毒疫苗应用。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种人工构建的表达缺陷型猪瘟病毒的载体，该载体能复制，表达和装配成缺失NS2基因的缺陷型猪瘟病毒。表达产生的病毒能在无其他任何辅助病毒的情况下产生致细胞病变，并能由感然细胞释放子代缺陷型猪瘟病毒作疫苗使用。本专利技术的另一个目的是提供一种缺失NS2基因的缺陷型猪瘟病毒。本专利技术的再一个目的是提供一种由缺失NS2基因的缺陷型猪瘟病毒在制备猪瘟病毒疫苗或猪瘟病毒检测试剂盒中的应用。一种表达猪瘟病毒标准强毒石门株的载体，该载体含有T7启动子和猪瘟病毒标准强毒石门株基因组的cDNA，其特征是，在T7启动子下游的cDNA中，缺失NS2基因中的1260个碱基对，仅保留5’端第3752碱基对至PshAI位点第3881碱基对之间130bp的NS2基因片段，其余cDNA序列与石门株感染性克隆cDNA相同，该cDNA具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，将cDNA片段插入到质粒载体pBR322的SalI和EcoRI双酶切位点之间而获得。该载体由下列方法制备A)构建猪瘟病毒标准强毒石门株的有感染性全长基因组克隆，分别得到克隆质粒pGEM70-1，pBlue12-4，pBR456-6；B)PCR扩增猪瘟病毒标准强毒石门株NS3基因；C)酶切pBlue12-4，去除大部分NS2基因片段，并同B中产物同框融合，得到重组质粒pD8-8；D酶切pGEM70-1并连接至pD8-8中，获得缺失NS2基因的重组质粒p5D8-1；E)将p5D8-1中的5’大片段与pBR456-6中完整的基因组3’大片段连接，连接产物克隆至pBR322载体中，转化E.coli DH10B，提取质粒pSMD8-6，形成表达缺陷型猪瘟病毒的载体。本专利技术进一步公开了该载体在转化过程中产生的病毒，在转化转录过程中产生的是缺失NS2基因的缺陷型猪瘟病毒。在本专利技术的一个具体实施例中，表达载体由下列方法制备A)构建野毒株的有感染性基因组克隆，分别得到重组质粒pGEM70-1，pBlue12-4，pBR456-6；B)PCR法扩增NS3基因，用BamHI对PCR产物进行酶切消化，酶切产物在37℃反应3小时后，用苯酚∶氯仿∶异戊醇抽提纯化，并对回收的酶切产物进行磷酸化处理，反应结束后回收并纯化出NS3基因片段。C)对pBlue12-4先进行BamHI酶切反应，纯化出酶切产物后继续用PshAI对线性化质粒进行第二次酶切，去除PshAI位点后面大部分NS2基因片段，仅保留其5’端(3752nt)-PshAI位点(3881nt)之间130bp的小片段。PshAI的切点同C中PCR扩增所得到的NS3基因磷酸化的5’平末端同框融合，二者在共有的BamHI粘性末端环化，得到NS2基因大部分缺失的重组质粒pD8-8。D)将cDNA0片段重组质粒pGEM70-1利用SalI和ClaI进行双酶切消化，在琼脂糖凝胶中回收cDNA插入片段，并连接至重组质粒pD8-8的SalI和ClaI之间，获得缺失NS2基因的5’大片段重组质粒p5D8-1。E)将p5D8-1携带缺失突变的5’大片段用SalI和BamHI双酶切的方法分离出来，与pBR456-6中完整的基因组3’大片段在BamHI位点连接，然后将连接产物克隆到经SalI和EcoRI双酶切处理的pBR322载体中，连接产物以常规方法转化E.coli DH10B，利用载体上的Ampicillin抗性标记筛选出阳性转化子，提取质粒pSMD8-6，得到了表达缺陷型猪瘟病毒的载体CCTCC M203072. 在本专利技术中，将载体转染入宿主细胞采用常规的脂质体介导的转染法。在一个具体的实施例中，采用Lipofectamine2000脂质体试剂，将pSMD8-6，CCTCCM203072转染PK15细胞系，培养液是含10％胎牛血清无双抗的DMEM。转染按Lipofectamine2000操作说明书进行，转染6小时后，除去转染介质，并用含1％胎牛血清的DMEM取代，DMEM培养基中含有107pfu vT本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种猪瘟病毒感染性ｃＤＮＡ载体的制备方法，该载体含有Ｔ７启动子和猪瘟病毒标准强毒石门株基因组的ｃＤＮＡ，其特征是，在Ｔ７启动子下游的ｃＤＮＡ中，缺失ＮＳ２基因中的１２６０个碱基对，保留５’端第３７５２碱基对至ＰｓｈＡＩ位点第３８８１碱基对之间１３０ｂｐ的ＮＳ２基因片段，其余ｃＤＮＡ序列与石门株感染性克隆ｃＤＮＡ相同，该ｃＤＮＡ具有ＳＥＱＩＤＮＯ．１所示的核苷酸序列且位于到质粒载体ｐＢＲ３２２的ＳａｌＩ和ＥｃｏＲＩ双酶切位点之间。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张楚瑜，吴海祥，郑从义，屈三甫，
申请(专利权)人：武汉大学，
类型：发明
国别省市：83[中国|武汉]