过滤载体及其应用制造技术

本发明专利技术提供一种用于筛选具有目标长度的寡聚核苷酸的过滤载体，其中所述过滤载体从5’至3’方向上包括启动子、报告基因和位于启动子与报告基因之间的至少一个酶切位点，其中所述具有目标长度的寡聚核苷酸在插入所述酶切位点之后不会导致针对所述报告基因的移码突变。本发明专利技术还提供所述过滤载体的构建方法及其在提高噬菌体或细菌基因文库的构建过程中所用的化学合成寡聚核苷酸的正确率中的应用。

【技术实现步骤摘要】


本专利技术涉及基因工程领域，具体地涉及一种用于化学合成的寡聚核苷酸质量检测及正确率提高的过滤载体。更具体地，本专利技术公开了一种用于筛选具有目标长度的寡聚核苷酸的过滤载体。本专利技术还提供所述过滤载体的构建方法及其在提高噬菌体或细菌基因文库的构建过程中所用的化学合成寡聚核苷酸的正确率中的应用。

技术介绍

通过化学方法合成的寡聚核苷酸在生命科学的应用非常广泛，比如基因的人工合成,基因测序以及通过PCR方法的基因扩增等等。目前寡聚核苷酸的化学合成主要通过亚磷酰胺法(Phosphoramiditechemistry),每个合成周期包含4个化学反应：去封闭、连接、加保护基团和氧化(Kosurietal(2014)NatureMethods11:499-507)。尽管每个化学反应的效率都已经优化,达到98％以上，但每步化学反应都不可能是100％准确的,所以通过化学方法合成的寡聚核苷酸都包含有不同程度的错误序列,而且错误的比例随着寡聚核苷酸长度的增长而显著增加(Baueretal(1989)NucleicAcidsRes.17:812Wosnicketal(1987)Gene60:115-127)。通过各种合成后的纯化手段,比如OPC、PAGE或HPLC,合成的寡聚核苷酸纯度会有所提高,但它们不能完全消除错误。寡聚核苷酸供应商报告的错误率约为1/100到1/1000(Heckeretal(1998)BioTechniques24:256-260)。
在所有通过化学方法合成的寡聚核苷酸的错误类型中，缺失一个或两个核苷酸(N-1、N-2)是最常见的(Heckeretal(1998)BioTechniques24:256-260McClainetal(1986)NucleicAcidsRes.14:6770)。这些来源于不完全化学反应的产物也是最难以去除的,因为它们和正确产物的区别很小。当这些带有N-1和N-2类型错误的寡聚核苷酸被整合到开放阅读框(ORFs),它们会引入移码突变，导致非功能性基因产物的产生。如果一个基因的合成或扩增只需要2条或几条寡聚核苷酸,而且通过下游的基因测序方法能够挑选出正确的序列,通常由单条寡聚核苷酸序列错误引起的问题不太严重。但是,当一个基因或其中的片段是由多条寡聚核苷酸拼接而成的时候,包含错误序列的比例会显著增加。比如,如果一条寡聚核苷酸的正确率为98％,那么由8条寡聚核苷酸组装而成的基因片段的正确率只有(0.986)85％。当这些带有错误序列的基因或片段被转化到噬菌体或细菌内时(比如在噬菌体或细菌基因文库的构建过程中),携带有包含错误序列基因的菌体通常比携带有包含正确序列基因的菌体有竞争优势,因为由正确序列编码的外源基因产物经常对菌体有毒性,因而抑制菌体的生长(Derdaetal(2011)Molecules16:1776-1803Knappiketal(2000)J.Mol.Biol.296:57-86Thomasetal(2010)Anal.Biochem.407(2):237-240)。因此提高正确基因序列的比例对高质量基因文库的构建是至关重要的。

技术实现思路

本专利技术提供了一种方法，用以检测化学合成的简并寡聚核苷酸的质量。同时也能有效地过滤掉不符合阅读框(out-of-frame)的寡聚核苷酸,从而增加简并寡聚核苷酸的正确率。这些质量得到提高了的寡聚核苷酸特别适合应用于各类基因文库的构建，构建的文库的全长基因正确率也因为寡聚核苷酸质量的提高而显著提高。
在本专利技术的一个方面，提供了一种用于筛选具有目标长度的寡聚核苷酸的过滤载体，其中所述过滤载体从5’至3’方向上包括启动子、报告基因和位于启动子与报告基因之间的至少一个酶切位点(优选这些酶切位点为过滤载体上仅有的单切位点，即在载体的其他部分不存在)，其中所述具有目标长度的寡聚核苷酸在插入所述酶切位点之后不会导致针对所述报告基因的移码突变。
在本专利技术的一个优选实施方案中，所述过滤载体在所述启动子和所述酶切位点之间还包括信号肽编码基因，优选所述信号肽为所述报告基因编码的报告蛋白的信号肽，还优选在信号肽编码基因和所述报告基因之间包括连接肽编码序列，优选所述连接肽在插入所述寡聚核苷酸的所述酶切位点之前，更优选在所述启动子与报告基因之间具有至少两个所述酶切位点，在这至少两个酶切位点之间包含终止密码子，最优选所述信号肽编码基因和所述报告基因处于所述启动子的控制之下并且两者的相对位置符合两者的阅读框(in-frame)。
在本专利技术的另一个优选实施方案中，所述过滤载体还任选地包括选择基因，优选所述选择基因和所述报告基因彼此不同并且独立地选自抗生素抗性基因、荧光素酶基因、β半乳糖苷酶基因、碱性磷酸酶基因、氨基酸合成基因(如果所用宿主菌株为氨基酸缺陷型)和它们的组合，更优选选自抗生素抗性基因如β内酰胺酶基因、四环素抗性基因或卡那霉素抗性基因，最优选所述报告基因是β内酰胺酶(TEM-1)或其成熟肽基因，所述选择基因是氯霉素乙酰基转移酶(CAT)基因。总之，可以选择任何合适的选择基因和报告基因，只要可以在宿主(如细菌)中进行筛选都满足条件。
在本专利技术还有的一个优选实施方案中，所述过滤载体是质粒载体，优选所述β内酰胺酶的成熟肽的氨基酸序列如SEQIDNo:1所示，所述氯霉素乙酰基转移酶(CAT)的氨基酸序列如SEQIDNo:2所示，所述信号肽的氨基酸序列如SEQIDNo:3所示，所述连接肽的编码序列如SEQIDNo:4所示，更优选在所述启动子与报告基因之间具有插入所述寡聚核苷酸的酶切位点PvuII位点和SpeI位点，在PvuII位点和SpeI位点之间包括终止密码子taa、tag或tga，还更优选PvuII位点和SpeI位点之间的序列如SEQIDNo:5所示。
在本专利技术还有的一个优选实施方案中，所述过滤载体是pFV02，其核苷酸序列如SEQIDNo:6所示。
在本专利技术还有的一个优选实施方案中，所述寡聚核苷酸是简并寡聚核苷酸，优选所述简并寡聚核苷酸的两端分别具有PCR引物引入的酶切位点，该酶切位点与位于所述过滤载体的启动子与报告基因之间的酶切位点相匹配以将所述简并寡聚核苷酸插入所述过滤载体的所述酶切位点之间，更优选与所述过滤载体的该酶切位点相同。应当指出，尽管简并寡聚核苷酸序列两端通常并不带有酶切位点，但是酶切位点是容易通过PCR引物引入的，因此，很方便地可以在简并寡聚核苷酸的两端引入任何酶切位点与过滤载体的相匹配。
在本专利技术的另一个方面，提供了一种构建过滤载体pFV02的方法，所述pFV02的核苷酸序列如SEQIDNo:6所示，所述方法包括以下步骤：
1)扩增CAT基因；
2)在pUC19质粒的β-内酰胺酶(TEM-1)基因两端插入AscI和NotI限制性内切酶位点，得到载体pUC19AN；
3)在β-内酰胺酶(TEM-1)成熟肽和信号肽之间插入酶切位点及连接肽，构建质粒pUC19ANL；
4)将CAT基因插入到上述构建的pUC19ANL质粒中，得到过滤载体pFV01；
5)通过定点突变的方法去除pFV01载体CAT基因内的两个PvuII酶切位点，得到的质粒为pFV01-2；和
6)在pFV01-02载体的β-本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于筛选具有目标长度的寡聚核苷酸的过滤载体，其中所述过滤载体从5’至3’方向上包括启动子、报告基因和位于启动子与报告基因之间的至少一个酶切位点，其中所述具有目标长度的寡聚核苷酸在插入所述酶切位点之后不会导致针对所述报告基因的移码突变。

【技术特征摘要】
1.一种用于筛选具有目标长度的寡聚核苷酸的过滤载体，其中所述过
滤载体从5’至3’方向上包括启动子、报告基因和位于启动子与报告基因之
间的至少一个酶切位点，其中所述具有目标长度的寡聚核苷酸在插入所述
酶切位点之后不会导致针对所述报告基因的移码突变。
2.根据权利要求1所述的过滤载体，其中所述过滤载体在所述启动子
和所述酶切位点之间还包括信号肽编码基因，优选所述信号肽为所述报告
基因编码的报告蛋白的信号肽，还优选在信号肽编码基因和所述报告基因
之间包括连接肽编码序列，优选所述连接肽在插入所述寡聚核苷酸的酶切
位点之前，更优选在所述启动子与报告基因之间具有至少两个酶切位点，
在这至少两个酶切位点之间包含终止密码子，最优选所述信号肽编码基因
和所述报告基因处于所述启动子的控制之下并且两者的相对位置符合两
者的阅读框。
3.根据权利要求1或2所述的过滤载体，其中所述过滤载体还任选地
包括选择基因，优选所述选择基因和所述报告基因彼此不同并且独立地选
自抗生素抗性基因、荧光素酶基因、β半乳糖苷酶基因、碱性磷酸酶基因、
氨基酸合成基因和它们的组合，更优选选自抗生素抗性基因，最优选所述
报告基因是β内酰胺酶(TEM-1)或其成熟肽基因，所述选择基因是氯霉素
乙酰基转移酶(CAT)基因。
4.根据权利要求3所述的过滤载体，其中所述过滤载体是质粒载体，
优选所述β内酰胺酶的成熟肽的氨基酸序列如SEQIDNo:1所示，所述氯
霉素乙酰基转移酶(CAT)的氨基酸序列如SEQIDNo:2所示，所述信号
肽的氨基酸序列如SEQIDNo:3所示，所述连接肽的编码序列如SEQID
No:4所示，更优选在所述启动子与报告基因之间具有插入所述寡聚核苷
酸的酶切位点PvuII位点和SpeI位点，在PvuII位点和SpeI位点之间包括
终止密码子taa、tag和tga中的一个或多个，还更优选PvuII位点和SpeI
位点之间的序列如SEQIDNo:5所示。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的过滤载体，其中所述过滤载体是
pFV02，其核苷酸序列如SEQIDNo:...

【专利技术属性】
技术研发人员：杜方勇，罗培志，
申请(专利权)人：天演药业苏州有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32