高效率转基因棉花表达载体与应用制造技术

本发明专利技术公开了一种植物表达载体及其应用。该植物表达载体包括表达ｔｆｄＡ基因的表达盒；所述表达盒由依次连接的ＣａＭＶ３５Ｓ启动子、ｔｆｄＡ基因和终止子组成；所述ｔｆｄＡ基因的核苷酸序列为序列表中序列２，所述ＣａＭＶ３５Ｓ启动子的核苷酸序列为序列表中序列１。本发明专利技术的载体的构建，对于棉花转基因研究：在棉花基因重组表达载体构建、基因转化（尤其为我国花粉管转基因提供了铁证）、转基因后代筛选、乃至整个棉花基因工程具有极为重大的应用价值。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种植物表达载体及其应用，特别是高效率转基因棉花表达载体与应用。
技术介绍
转基因动物最早的典型例子是1982年由美国华盛顿大学Palmiter等报告的“超 级小鼠”。但在这之前，1974年，Jaenisch等用显微注射的方法将SV40的DNA导入到小鼠的 胚囊中，在自带小鼠的肝、肾组织中检测到了 SV40的DNA，这证明将外源基因导入胚胎细胞 中并实现整合是可能的。1980年，Gordon等采用受精卵原核显微注射法，首次成功地将疱 疹病毒和SV40的DNA片段导入小鼠基因组，当时Gordon和Ruddle称这种转化小鼠为“转 基因小鼠”。转基因植物，1983年采用农杆菌介导方法培育出世界上第一例转基因植物——转 基因烟草。现在基因工程已遍及各种动植物及微生物，由于分子生物学技术的飞速发展，转 基因对于改良动植物品质、提高抗逆性以及生物医药领域正在发挥巨大的作用。国内外植物转基因方法在植物基因转化的研究中已建立了多种转化方法载体 转化系统、原生质体DNA直接导入转化、基因枪DNA导入转化、花粉管通道法等。目前应用 最多、机理研究最明确的为载体转化系统，其载体包括Ti质粒、Ri质粒及病毒转化载体等。 花粉管通道转基因方法由我国科学家专利技术周光宇在广泛调查国内外远缘杂交工作的基础 上，提出DNA片段杂交假说，并设计了外源DNA直接导入受体的花粉管通道法。通常转基因需要构建高效表达载体，为了使得转基因后的植株容易筛选，一般采 用双元表达载体。常用的植物表达载体为PBI121和pCambia系列。筛选标记基因是指在 遗传转化中能够使转化细胞(或个体)从众多的非转化细胞中筛选出来的标记基因。它们 通常可以使转基因细胞产生对某种选择剂具有抗性的产物，从而使转基因细胞在添加这种 选择的培养基上正常生长，而非转基因细胞由于缺乏抗性则表现出对此选择剂的敏感性， 不能生长、发育和分化。在构建载体时，筛选标记基因连接在目的基因一旁，两者各有自己 的基因调控序列(如启动子、终止子等)。目前常用的筛选标记基因主要有两大类抗生素 抗性酶基因和除草剂抗性酶基因。前者可产生对某种抗生素的抗性，后者可产生对除草剂 的抗性。使用最多的抗生素抗性酶基因包括NPTII基因(产生新霉素磷酸转移酶，抗卡那霉 素)、HPT基因(产生潮霉素磷酸转移酶，抗潮霉素)和Gent基因(抗庆大霉素)等。常用 的抗除草剂基因包括EPSP基因(产生5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶，抗草甘磷)、 GOX基因(产生草甘膦氧化酶、降解草甘膦)、bar基因(产生PPT乙酰转移酶，抗Bialaphos 或glufosinate)等。其中pCambial301和pCambia3301较为常用。近几年来，转基因植物 中筛选标记基因的生物安全性已引起全球关注。例如，人们担心转基因植物的抗生素抗性 标记基因转移进入人或动物的病原菌中，从而引起这些病原菌对抗生素的抗性，使抗生素 失去效力。pCambia3301采用的bar基因作为标记基因，对转基因后代采用喷施Basta(—种除草剂)来筛选可以获得转基因阳性植株。但经过多年研究发现，喷施Basta对于筛选棉 花转基因阳性植株准确性不高，同时由于国内许多研究部门采用我国首创的花粉管通道转 基因方法，若采用该载体更难以获得令国际同行信服的研究结果。PCAMBIA1301载体采用超霉素筛选，也不适合棉花转基因。为此我们经过多年研 究，构建了 PSPT高效植物表达载体。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种植物表达载体及其应用。该植物表达载体可以高效率培 育转基因棉花。本专利技术所提供的植物表达载体，包括表达tfdA基因的表达盒；所述表达盒由依次 连接的CaMV35S启动子、tfdA基因和终止子组成；所述tfdA基因的核苷酸序列为序列表中 序列2，所述CaMV35S启动子的核苷酸序列为序列表中序列1。所述植物表达载体中还包括Flag标签，Flag标签的核苷酸序列为序列表中序列 3。所述植物表达载体的基础构架载体为pcambial300。所述植物表达载体按照下述方法构建1)将CaMV35S启动子连接于tfdA基因的5'端获得的片段插入到pCambial300 的BstXI和XhoI酶切位点之间，获得重组载体A ；2)将序列表中序列3所述的Flag标签片段插入重组载体A的多克隆位点，获得所 述植物表达载体。所述步骤2)中，所述的Flag标签片段优选先用XbaI和HindIII双酶切后，回收 Flag标签片段，插入重组载体A的XbaI和HindIII之间。所述步骤1)中，所述pCAMBIA1300中驱动目的基因表达的启动子(多克隆位点前 的启动子)替换为super强启动子，所述super强启动子的核苷酸序列为序列表中序列5。所述步骤1)中，所述pCAMBIA1300的多克隆位点的酶切位点改造为Sail、KpnI, BamI、SpeI、Sail、ApaI、SmaI、SwaI、PstI、HindIII、XbaI 及 AccIII0本专利技术的植物表达载体可用于培育转基因棉花，并具有如下优势本专利技术的pSPT载体具有如下优势(1)目的基因得到超强表达。Super强启动子可以保证目的基因转化植物后得到 高剂量表达，以便于对目的基因的功能分析，同时对于提高转基因植物在抗性、产量及品质 等方面发挥作用。(2)转基因阳性植株(尤其棉花等双子叶植物)便于简易、快速、准确筛选。由于 棉花等双子叶植物对植物生长调节剂2. 4-D极为敏感，可用苗期喷施2. 4-D方法区分转基 因与野生型植株。用质量百分浓度为0. 003% -0. 005%的2. 4-D 丁酯溶液喷洒转基因幼苗， 一般7-10天即可区分正常株与异常植株，由于转基因阳性植株携带有tfdA基因，因此抗 2. 4-D表现新叶正常生长；异常株由于则不携带tfdA基因，因而新长出叶片表现畸形(图 3)。在转基因后代筛选时利用这一手段，准确性近乎可达到100%。(3)容易区分外源导入及内源基因。由于通常克隆的基因来源于植物本身，为区分 转基因与植物本身已有的基因，我们在目的基因的5’端增加了 Flag序列，在经过标记基因4识别基础上，还可以5’端的Hag序列设计通通用引物，结合外源基因的5’端特异引物，只 需利用PCR即可证明阳性植株确实存在外源基因(图4)。(4)为花粉管转基因方法提供了铁证。棉花的花粉管通道转基因方法由我国科学 家提出，一直没有得到国际主流科学家的认可，我们利用该载体构建包含目的基因的重组 载体，利用花粉管通道转基因后，对获得的混合种子以及由此种出幼苗喷施2. 4-D识别，结 合对转基因T3代的Southern杂交(图4)及Northern杂交(图5)，有利地证明了转基因 阳性植株的可靠性，从而为花粉管通道转基因方法的可行性提供了铁证。本专利技术的载体的构建，对于棉花转基因研究在棉花基因重组表达载体构建、基因 转化(尤其为我国花粉管转基因提供了铁证)、转基因后代筛选、乃至整个棉花基因工程具 有极为重大的应用价值。附图说明图1为pSPTOl载体构建过程示意图。图2为pSPT载体结构示意图。图3为转基因阳性植株田间筛选结果，阳性植株真叶生长正常(右，阳性株)，非转 基因株真叶为畸形(左，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种植物表达载体，包括表达ｔｆｄＡ基因的表达盒；所述表达盒由依次连接的ＣａＭＶ３５Ｓ启动子、ｔｆｄＡ基因和终止子组成；所述ｔｆｄＡ基因的核苷酸序列为序列表中序列２，所述ＣａＭＶ３５Ｓ启动子的核苷酸序列为序列表中序列１。

【技术特征摘要】
一种植物表达载体，包括表达tfdA基因的表达盒；所述表达盒由依次连接的CaMV35S启动子、tfdA基因和终止子组成；所述tfdA基因的核苷酸序列为序列表中序列2，所述CaMV35S启动子的核苷酸序列为序列表中序列1。2.根据权利要求1所述的植物表达载体，其特征在于所述植物表达载体中还包括 Flag标签，所述Flag标签的核苷酸序列为序列表中序列3。3.根据权利要求1或2所述的植物表达载体，其特征在于所述植物表达载体的基础 构架载体为PCAMBIA1300。4.根据权利要求1或2或3所述的植物表达载体，其特征在于所述植物表达载体按 照下述方法构建1)将CaMV35S启动子连接于tfdA基因的5'端获得的片段插入到pCAMBIA1300的 BstXI和XhoI酶切位点之间，获得重组载体A ；2)将序列表中序列3所述的Flag标签片段插入重组载体A的多克隆位点，...

【专利技术属性】
技术研发人员：齐俊生，巩志忠，陈智忠，王妍卿，罗祖勇，张定朋，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]