一种提高棉花转基因效率的方法技术

本发明专利技术提供了一种提高棉花转基因效率的方法，所述方法含有以下步骤：a.采用农杆菌介导法将含有目的基因的植物表达载体侵染棉花无菌苗茎尖，将侵染后的棉花茎尖置于共培养培养基上进行共培养；b.共培养后，将棉花茎尖转入筛选培养基上培养；所述共培养培养基与筛选培养基中均含有浓度为0.3mg/L的KT和浓度为0.2mg/L的IAA。利用本发明专利技术方法进行无菌苗培养时间2-3天，共培养2天，筛选培养15-20天，生根培养20天，转化周期不超过2个月，且经筛选后阳性转化率能达到8％。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及棉花转基因
，具体地说，涉及。
技术介绍
利用基因工程技术对棉花进行遗传改良已取得重要进展。1987年Umbeck等首次报道通过农杆菌介导法将抗卡那霉素基因转入棉花(Umbeck P.Genetically transformedcotton (Gosspium hirsutum L.) Plants.Bio/Teehnology, 1987, 5:263 ~266)。传统的遗传转化方法转化周期长、植株再生的基因型依赖性强、再生苗畸形率高、移栽成活率低，成为限制棉花转基因育种研究的瓶颈。棉花茎尖具有直接分化再生的特点，一经转化就可以在适当培养条件下诱导叶、根的形成而获得转基因植株。农杆菌介导的茎尖转化方法不仅能够解决基因型依赖性问题，还可缩短转化周期和提高移栽成活率。Renfroe等利用棉花茎尖分生组织获得再生植株以来，国内外很多学者也相继利用茎尖分生组织获得了棉花再生植株(RenfroeMH&Smith RH.1solation and culture of cotton protoplasts.Proc.Beltwide CottonProd.Conf., Natl.Cotton Council, Memphis, 1986, TN: 79 - 80)吕素莲等利用棉花茎尖遗传转化方法将胆碱脱氢酶基因betA和突变的乙酞乳酸合成酶基因als成功转入到3个棉花优良品种中，并获得了抗除草剂氯磺隆和耐盐性提高的转基因植株及后代(吕 素莲等.农杆菌介导的棉花茎尖遗传转化及转betA植株的产生.高技术通讯，2004，11:20-25.)。但该技术方案主要是体外茎尖转化法，没有经过棉花细胞和组织培养过程，嵌合体几率增加，不能稳定遗传，后代不符合孟德尔遗传规律。然而，许多经过了细胞和组织培养的棉花转基因方法(如通过下胚轴转化的方法)，由于下胚轴要经过愈伤组织的诱导及分化，转化周期较长，一般6-9个月(刘明月，农杆菌介导棉花遗传转化体系优化，2011，第9页)，且受转化受体基因型的限制。还有一些茎尖为受体的基因枪转化方法，但较农杆菌转化方法而言，费用高，且有瞬时表达和嵌合体现象发生。有其他农杆菌介导的茎尖转化方法表明，从共培养到获得抗性株需3-4个月，周期较长(徐大伟等，2011年，中国农学通报)。
技术实现思路
为了解决现有技术中存在的问题，本专利技术的目的是提供一种缩短棉花转化周期，提高棉花转基因效率的方法。为了实现本专利技术目的，本专利技术首先提供，所述方法含有以下步骤:a.采用农杆菌介导法将含有目的基因的植物表达载体侵染棉花无菌苗茎尖，将侵染后的棉花茎尖置于共培养培养基上进行共培养；b.共培养后，将棉花茎尖转入筛选培养基上培养；所述共培养培养基与筛选培养基中均含有浓度为0.3mg/L的激动素(KT)和浓度为0.2mg/L的吲哚-3-乙酸(IAA)。进一步地，侵染后的棉花茎尖置于共培养培养基上在21°C下暗培养48小时。进一步地，共培养后将棉花茎尖转入筛选培养基上培养12-15d后，将生根和叶片正常的植株转入生根培养基。进一步地，所述棉花无菌苗茎尖的培养方法为:将棉籽剥壳后露出棉仁，在无菌环境中用75%的酒精消毒Imin, 0.1%升萊消毒12min,再用无菌水清洗3_4次后,加入无菌水置于IOOrpm摇床中28°C培养至吸胀露白，置于种苗培养基上，28°C下暗培养2_3d后，将棉花无菌苗去掉子叶及叶原基，露出生长点并用解剖刀划伤生长点，留取子叶下部约0.5~1.0cm部分成为棉花无菌苗茎尖。本专利技术还提供了一种提高棉花转基因效率的共培养培养基，所述共培养培养基含有 0.3mg/L KT 和 0.2mg/L IAA。进一步地，所述共培养培养基含有MSB5、200 μ M乙酰丁香酮、30g/L葡萄糖和2.4g/L植物凝胶。MSB5是指MS无机盐和B5有机物。本专利技术还提供了一种提高棉花转基因效率的筛选培养基，所述筛选培养基含有0.3mg/L KT 和 0.2mg/L IAA。 进一步地，所述筛选培养基含有MSB5、200mg/L头孢霉素(cef)、80mg/L卡那霉素(kan)、15g/L葡萄糖、15g/L蔗糖、2.4g/L植物凝胶。本专利技术还提供了前述共培养培养基和筛选培养基在提高棉花转基因效率中的应用。本专利技术的有益效果在于:本专利技术通过设置不同的激素(组合)，优化了农杆菌介导的茎尖转化技术体系，使转化周期缩短，转化率提高。利用本专利技术方法进行无菌苗培养时间2-3天，共培养2天，筛选培养15-20天，生根培养20天，转化周期不超过2个月，且经筛选后阳性转化率能达到8 %。目前能够获得再生植株的基因型多数为生产上淘汰的老品种，直接利用的价值不大，获得的转基因材料要通过杂交和多代回交，才能够在生产上利用，大大降低了转基因育种的利用价值。本专利技术采用的冀棉14农艺性状较传统的易转化的老品种好。本专利技术中获得的转基因植株易生根，且易直接移栽，成活率达99%以上。移栽时土也不需要灭菌，较转基因苗的嫁接及直接移栽灭菌土省力又省时。本申请选用生长2-3天的无菌苗茎尖为外植体，保证外植体的较强分裂和转化能力。外植体的侵染时间也影响转化率，侵染时间过长易引起后续实验中的污染，侵染时间过短又造成转化率低，因此本案中侵染15-20min，能保证较高的转化率。【附图说明】图1为本专利技术实施例中茎尖转化过程图；其中，a.无菌苗；b.去掉子叶的茎尖；c.茎尖生长点；d.共培养；e.筛选初期；f.筛选后期；g.生根后炼苗；h.炼苗后移栽所述方法。图2为本专利技术实施例中再生植株DNA的PCR扩增电泳检测图。【具体实施方式】以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。实施例1提高棉花转基因效率I材料和方法1.1试验材料本试验供试材料为陆地棉(G.hirsutum L.)品种:冀棉14。转化菌株:根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens) LBA4404。转化基因GbAPX来自本实验室构建的受黄萎病菌(Verticillium dahliae)胁迫的海岛棉品种Pima90-53根组织转录组文库。1.2主要试剂与药品乙酰丁香酮、植物凝胶(phytagel)、植物生长调节剂(IAA和KT)、卡那霉素及头孢霉素OPCR引物主要由生工生物工程有限公司合成。1.3试验方法 1.3.1培养基制备根据表1制备所需培养基。表1试验所用的培养基本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种提高棉花转基因效率的方法，其特征在于，所述方法含有以下步骤：a.采用农杆菌介导法将含有目的基因的植物表达载体侵染棉花无菌苗茎尖，将侵染后的棉花茎尖置于共培养培养基上进行共培养；b.共培养后，将棉花茎尖转入筛选培养基上培养；所述共培养培养基与筛选培养基中均含有浓度为0.3mg/L的激动素和浓度为0.2mg/L的吲哚‑3‑乙酸。

【技术特征摘要】
1.一种提高棉花转基因效率的方法，其特征在于，所述方法含有以下步骤: a.采用农杆菌介导法将含有目的基因的植物表达载体侵染棉花无菌苗茎尖，将侵染后的棉花茎尖置于共培养培养基上进行共培养； b.共培养后，将棉花茎尖转入筛选培养基上培养； 所述共培养培养基与筛选培养基中均含有浓度为0.3mg/L的激动素和浓度为0.2mg/L的吲哚-3-乙酸。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，侵染后的棉花茎尖置于共培养培养基上在21°C下暗培养48小时。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，共培养后将棉花茎尖转入筛选培养基上培养12-15d后，将生根和叶片正常的植株转入生根培养基。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述棉花无菌苗茎尖的培养方法为:将棉籽剥壳后露出棉仁，在无菌环境中用75%的酒精消毒lmin，0.1%升汞消毒12min，再用无菌水清洗3-4次后，加入无菌水置于IOOrpm摇床中28°C培养至吸胀露白，置于种苗培养基上，...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴金华，王省芬，张桂寅，吴立强，李志坤，张艳，王国宁，柯会锋，马峙英，
申请(专利权)人：河北农业大学，
类型：发明
国别省市：河北;13