棉花GbABR1基因在抗黄萎病中的应用制造技术

本申请属于基因棉花抗性育种技术领域，具体涉及棉花GbABR1基因在棉花抗黄萎病中的应用的专利申请。所述GbABR1基因，蛋白序列分析表明，其含有一个典型的高度保守的AP2/EREBP结构域；该基因属于ERF类B4成员，属海岛棉中AP2家族成员；亚细胞定位结果表明，该基因定位于细胞核中；当棉花受到黄萎病菌的侵染后，该基因表达量有明显提高。应用实验表明，在将基因进行沉默后，棉花植株对黄萎病比较敏感，而当该基因超表达后，新的植株体对黄萎病侵染表现出明显的抗性。基于此研究结果，可为黄萎病抗性的分子机制研究、新的抗黄萎病植物新品种培育奠定一定应用基础。

【技术实现步骤摘要】

本申请属于棉花抗性育种
，具体涉及棉花GbABR1基因在棉花抗黄萎病中的应用的专利申请。
技术介绍
棉花是世界及中国最重要的经济作物之一，对棉花种植影响非常严重的一种生物胁迫是黄萎病。棉花黄萎病严重影响棉花的产量和品质，深入研究棉花与黄萎病菌之间的互作机制，弄清棉花抗黄萎病病相关基因的生物学功能，是当前棉花抗黄萎病研究的重要课题。由于植物对生物胁迫（如黄萎病病害等）和非生物胁迫（干旱胁迫、高盐胁迫和低温胁迫等）等的防御机制涉及多个途径（基因）参与，分析研究作物抵抗逆境胁迫的机制，进而运用该调控机制来增加作物的产量是现代育种常用的方法之一。植物中存在大量抗逆相关的转录因子，许多转录因子通过和靶基因启动子上的作用元件互相结合使之发挥作用，调节下游多种植物抗逆相关的功能基因发挥作用，从而调控植物的对逆境的适应性；因而植物转录因子的调控研究成为植物的重点研究内容之一。AP2/EREBP(APETALA2/Ethylene-responsiveelementbindingprotein)是一个转录因子的超家族，它是在植物中特有的转录因子。转录因子(Transcriptionfactor)，即反式作用因子(Trans-actingfactor)是指定位于真核细胞核内，通过与被调控基因5’端启动子区的顺式元件(Cis-actingelement)发生特异性结合和互作，达到对该基因转录过程的激活或抑制的一类DNA结合蛋白。当植物受到外界的干旱、高温等非生物胁迫时，植物会通过一系列的信号传递激发转录因子。被激发的转录因子会与相应的顺式作用元件相结合启动特定基因的表达，从而对非生物胁迫进行应答。转录因子在高等植物的生长发育以及对生物和非生物的胁迫应答中起着十分重要的调控作用。AP2这类基因家族成员的共同特点是：都具有一个AP2的DNA结合域。在植物拟南芥，因为结构域的区别可以分为AP2、RAV、ERF、DREB和一个孤独基因，只有一个AP2结构域的是DREB亚组和ERF亚组；AP2亚组有两个AP2结构域。RAV亚组含有AP2和B3两个结构域。在1995年的时候，在烟草中，有4个ERF1/2/3/4转录因子可以与GCC-box结合的ERF类转录因子，它们是通过乙烯应答元件为探针找到的的蛋白，命名为乙烯响应因子(ERF)。ERF类亚组有一个AP2的结构域，每个AP2结合域里都包含着2个保守元件YRG元件、RADY元件，YRG元件中用一个由19~22个氨基酸残基组成的碱性亲水区作为它的保守氨基酸基序；RAYD的保守序列是由42~43个氨基酸所组成的。对ERF蛋白质的三维结构分析，发现在β-折叠中的第14位的丙氨酸和第19位的天冬氨酸，它们可以和GCC-box顺式作用元件特异的结合。Sakuma等把ERF亚组又划分成6个亚组，B1-B6。他的划分是通过它翻译的蛋白中有哪些氨基酸。同时它根据保守区域的特点对ERF转录因子基因的功能进行了功能分析。转录调控和转录后调控在植物细胞适应外界环境变化方面均起到了重要作用。Golldack等指出，调控过程的灵活性和转录后修饰决定了环境适应中转录因子的功能特异性。ERF转录因子通过与病程相关基因启动子中的GCC-box(GCCGCC)的结合直接调控病程相关基因，诸如prb-1b(PR1)，β-1,3-葡聚糖酶(PR2)，几丁质酶(PR3)和osmotin(PR5)的表达。ERF族转录因子的的特征，所以基因ERF在某个方面能调节棉花抗病抗逆，基因有DNA的结合域，能使一些PR基因表达，使棉花防御能力提高。PR基因的启动子中有GCC-box作用元件，在抗逆、抗病等上都有很重要的作用，因为这类基因常常可以因为乙烯处理然后被诱导，也被叫做乙烯应答元件。研究发现ERF的结构域与GCC-box元件结合的必要条件是在结构域的N端的保守氨基酸，他们研究了很多蛋白的ERF结构域，实验表明GCC-box中有11个关键碱基就可以稳定的和ERF结构域互作且ERF结构域中保守的N端起着与GCC-box稳定结合的作用，不相同的C端，而能辨别不相同的特异结合。综上所述ERF蛋白能够和不同的顺式元件的结合，从而调节一些环境胁迫的应答。另外研究发现ERF结构域中如果能有一些磷酸化位点，那么它们对ERF抗逆境胁迫的功能会发挥作用。基于ERF类转录因子功能的多样性，因此GbABR1与黄萎病间的作用机制也有必要加以研究，从而为黄萎病的预防和控制提供一定的借鉴和参考。
技术实现思路
在前期棉花抗黄萎病基因筛选基础上，本专利技术主要目的是提供了具有一定抗黄萎病应用前景的GbABR1基因，从而为新的抗黄萎病棉花品种的培育奠定一定应用基础。本申请所采取的详细技术方案如下。棉花GbABR1基因在抗黄萎病中的应用，所述GbABR1基因，GenBank编号为KP259809，其ORF有1113bp，蛋白序列分析表明，其含有一个典型的高度保守的AP2/EREBP结构域；该基因属于ERF类B4成员，属海岛棉中AP2家族成员；亚细胞定位结果表明，该基因定位于细胞核中；基因表达检测结果表明，该基因在棉花的根、茎、叶中均有表达，当棉花受到黄萎病菌的侵染后，该基因表达量有明显提高，此结果表明该基因在在棉花黄萎病生物胁迫信号转导途径中具有重要作用。进一步VIGS技术应用结果表明，将GbABR1基因沉默后，植株黄萎病发病率及病情指数提升，而将该基因超表达后，植株黄萎病发病率及病情指数下降，因此，GbABR1基因是棉花抗黄萎病的正调控因子。在前期对棉花黄萎病诱导相关基因研究基础上，专利技术人对其中表达量差异明显的EST序列进行了测序，即本申请中所述的GbABR1基因。进一步地，通过电子克隆技术，在海岛棉中成功克隆获得了这个基因，并对其生物学信息进行了详细分析。更进一步应用实验表明，在将这个基因进行沉默，植株的抗病性降低，而进行超表达后，植株对黄萎病侵染表现出抗病的性状特征，从而表明这个基因与黄萎病的抗性高度相关。基于此研究结果，可为黄萎病抗性的分子机制研究、新的抗黄萎病植物新品种培育奠定一定应用基础，同时也为新的抗病基因筛选及抗性植物培育提供了新的借鉴和参考。附图说明图1为PCR产物电泳检测，其中M:45000bpladderMarker；1-2：PCR产物；图2为GbABR1蛋白的三维结构预测；图3为ABR1蛋白AP2/EREBP结构域的氨基酸序列比对分析；图4为棉花AP2转录因子的进化树分析；图5为棉花GbABR1转录因子的亚族进化树分析；图6为融合表达载体p35S-GFP::GbABR1转入农杆菌GV3101后菌液PCR检测；其中2K：2000bpladderMarker；1-13：菌液PCR检测N:阴性对照P:阳性对照；图7为农杆菌介导的烟草叶片瞬时转48h后观察GFP::GbABR1融合蛋白表达情况；图8为GbABR1在不同棉花组织（根、茎、叶）中表达量的qRT-PCR结果；图9为GbABR1表达模式的分析结果，其中(A)海岛棉海15根系在黄萎病菌V991侵染后，GbABR1基因表达模式的RT-PCR分析结果；(B)海岛棉海15根系在黄萎病菌V991侵染后，GbABR1基因表达模式的qRT-PCR分析结果；图10为对照(TRV:0本文档来自技高网...

【技术保护点】
棉花GbABR1基因在抗黄萎病中的应用，其特征在于，所述GbABR1基因，GenBank编号为KP259809，其ORF有1113bp，蛋白序列分析表明，其含有一个典型的高度保守的AP2/EREBP结构域；该基因属于ERF类B4成员，属海岛棉中AP2家族成员；亚细胞定位结果表明，该基因定位于细胞核中；该基因在棉花的根、茎、叶中均有表达，当棉花受到黄萎病菌的侵染后，该基因表达量有明显提高。

【技术特征摘要】
1.棉花GbABR1基因在抗黄萎病中的应用，其特征在于，所述GbABR1基因，GenBank编号为KP259809，其ORF有1113bp，蛋白序列分析表明，其含有一个典型的高度保守的AP2/EREBP结构域；该基因属于ERF类B4成员，属海岛棉中AP2家族成员；亚细胞定位结果表明，该基因定位于细胞核中；该基因在棉花的根、茎、叶中均...

【专利技术属性】
技术研发人员：蔡应繁，刘鑫，龙璐，孙全，王微娜，张骁，
申请(专利权)人：河南大学，
类型：发明
国别省市：河南;41