一种通过转CmTCP20基因调控菊花花瓣生长的方法技术

本发明专利技术属于植物基因工程和转基因育种领域，涉及一种通过转CmTCP20基因调控菊花花瓣生长的方法，包括以下步骤：从切花大菊‘神马’中克隆CmTCP20基因；构建CmTCP20基因植物表达载体；采用农杆菌介导法将其转入菊花中，进行培养初步获得抗性植株。对转化植株进行PCR、定量RT-PCR检测证实CmTCP20内源基因已经整合到转基因植株的基因组DNA中并发生转录。对转基因植株进行表型观察与统计分析，发现与未转基因植株相比，转基因植株的花瓣生长量明显变大。本发明专利技术通过转化内源CmTCP20转录因子并正常转录表达，从而调控了切花菊花瓣的生长，为利用基因工程技术提高切花菊观赏品质提供新颖而实用的方法，将有效推动菊花生物技术育种进程。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于植物基因工程和转基因育种领域，涉及一种通过转CmTCP20基因调控菊花花瓣生长的方法。
技术介绍
菊花(Chrysanthemummorifolium)是我国传统十大名花和世界四大切花之一，其栽培历史悠久。菊花具有丰富的花色、多样的花姿等特点，深受人们的喜爱，在世界范围内广为栽培。TCP家族是最近十几年来发现的植物特有的一类转录因子，因其在植物形态发育和进化中起着重要作用而受到广泛的关注。越来越多的研究表明，TCP基因家族参与花器官形态建成，如PsCYCs基因在豌豆花中呈不对称表达模式(王峥，2006)。目前TCP基因在花型中的研究多集中于花对称性发育。花对称性发育的分子机理首先在模式植物金鱼草中被发现，其花部对称的表型由CYCLOIDEA(CYC)和DICHOTOMA(DICH)基因共同控制(李交昆，唐璐璐，2012)。CYC和DICH基因同属TCP基因家族。因此，TCP基因家族与花瓣发育有着密切的关系。近年来，随着分子生物学的迅速发展，通过遗传转化的技术在植物体内过量表达特定的内源基因以提高植物抗逆性已成为现代育种的重要手段。采用农杆菌介导法可以获得具有不同生物学特性的转基因菊花，如菊花花色、形状、高度、株型等园艺特征的改变，转基因技术为改良菊花品种提供了新的手段和途径。而利用农杆菌介导法提高植株抗性的研究报道也有很多，TCP14/TCP15:SRDX转基因植株会导致萼片、花瓣和心皮的发育畸形，几乎不形成花瓣(Kiefferetal.2011)。Narumi等(2011)在夏堇中沉默TCP3基因后发现，叶片变小且边缘呈波浪形，花瓣边缘也呈现出锯齿状，且花瓣颜色明显变浅。GhCYC2在管状花发生的部位几乎不表达，但其超表达会导致管状花发育成舌状花的形态(Broholmetal.2008)，且管状花花瓣更长，有明显的唇瓣结构，雄蕊发育中断且无花粉，舌状花的花瓣明显变短(Tahtiharjuetal.2012)，而GhCYC5的功能不同，其在非洲菊头状花序的膨大过程中能够促进更多花原基的发生，进而导致花托上产生更多的小花(Juntheikki-Palovaaraetal.2014)。以上研究表明，TCP基因家族参与植物花器官的生长发育调控，但在不同植物中发挥作用的TCP家族成员及其功能均存在差异，TCP调控花瓣的生长的具体机制还缺乏系统深入研究。因此通过农杆菌介导法将菊花的内源基因CmTCP20导入切花菊‘神马’调控花瓣生长是一种新的探索，为采用基因工程技术选育菊花观赏品种提供新颖而实用的方法。参考文献：李交昆,唐璐璐.花对称性的研究进展[J].生物多样性,20(3):280-285,2012.王峥,豌豆花瓣发育的分子生物学研究(博士研究生学位论文).上海:中国科学院上海植物生理生态研究所,2006.BroholmSK,TahtiharjuS,LaitinenRA,AlbertVA,TeeriTH&ElomaaP(2008)ATCPdomaintranscriptionfactorcontrolsflowertypespecificationalongtheradialaxisoftheGerbera(Asteraceae)inflorescence.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica,105(26):9117-22.EvyatarSteiner,OsnatYanai,IdanEfroni,NaomiOri,YuvalEshed,DavidWeiss.(2012)ClassITCPsmodulatecytokinin-inducedbranchingandmeristematicactivityintomato.PlantSignaling&Behavior7:7,807-810.Irish,V.F.(2008)TheArabidopsispetal:amodelforplantorganogenesis.Trendsinplantscience.13(8):p430-436.Juntheikki-PalovaaraI,TahtiharjuS,LanTY,BroholmSK,RijpkemaAS,RuonalaR,KaleL,AlbertVA,TeeriTH&ElomaaP(2014)FunctionaldiversificationofduplicatedCYC2cladegenesinregulationofinflorescencedevelopmentinGerberahybrida(Asteraceae).PlantJournal,79(5):783-796.Kawabata,S.,K.Nii,andM.Yokoo.(2011)Three-dimensionalformationofcorollashapesinrelationtothedevelopmentaldistortionofpetalsinEustomagrandiflorum.ScientiaHorticulturae.KiefferM,MasterV,WaitesR&DaviesB(2011)TCP14andTCP15affectinternodelengthandleafshapeinArabidopsis.PlantJournal,68(1):147-58.Liang,H.andL.Mahadevan.(2011)Growth,geometry,andmechanicsofabloominglily.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences.108(14):p5516.MizukamiY.(2001)Amatterofsize:developmentalcontroloforgansizeinplants.CurrentOpinioninPlantBiology,4:533-539.NarumiT,AidaR,KoyamaT,YamaguchiH,SasakiK,ShikataM,NakayamaM,Ohme-TakagiM&OhtsuboN(2011)ArabidopsischimericTCP3repressorproducesnovelfloraltraitsinToreniafournieriandChrysanthemummorifolium.PlantBiotechnol,28(2):131-140.SariT,AnnekeSR,AdrienV,Vict本文档来自技高网...

【技术保护点】
可调控菊花花瓣生长的基因CmTCP20，该基因的序列为SEQ ID NO.1。

【技术特征摘要】
1.可调控菊花花瓣生长的基因CmTCP20，该基因的序列为SEQIDNO.1。
2.如SEQIDNO.1所示的CmTCP20基因在调控菊花花瓣生长中的基因工程应用。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于将CmTCP20基因植物表达载体导入切花
菊，促进菊花花瓣的生长，提高菊花观赏性。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述CmTCP20基因植物表达载体的构建
方法为：以切花大菊‘神马’花瓣的cDNA为模板，设计引物CmTCP20-GATE-F和
CmTCP20-GATE-R，进行PCR反应，在CmTCP20基因的上游和下游分别引入BamHI和
NotI酶切位点，将PCR产物连接到pMD19-T载体，转化DH5α感受态细胞，提取阳性质
粒，将提取的阳性质粒由BamHI和NotI双酶切得到的CmTCP20片段与BamHI和NotI双
酶切的pENTRTM1A连接，转化，提取的阳性质粒经PvuI单酶切线性化后与植物表达载体
pMDC43质粒进行LR重组反应，转化，提取阳性质粒，植物表达载体pMDC43-CmTCP20
构建成功；所述的引物序列如下：
上游引物CmTCP20-GATE-F：5′-CGCGGATCCGGATGACTGATCCCAACACC-3′(SEQ
IDNO.4)，
下游引物CmTCP20-GATE-R：5′-TTGCGGCCGCGACTGACCCTCTGAACCTCG-3′
(SEQIDNO.5)。
5.一种通过转CmTCP20基因调控菊花花瓣生长的方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)以切花大菊‘神马’为材料，提取花瓣的总RNA，进行反转录获得cDNA；
(2)构建CmTCP20基因植物表达载体：以步骤(1)获得的cDNA为模板，设计引物
CmTCP20-GATE-F和CmTCP20-GATE-R，进行PCR反应，在CmTCP20基因的上游和下游
分别引入BamHI和NotI酶切位点，将PCR产物连接到pMD19-T载体，转化DH5α感受态
细胞，提取阳性质粒，将提取的阳性质粒由BamHI和NotI双酶切得到的CmTCP20片段与
BamHI和NotI双酶切的pENTRTM1A连接，转化，提取的阳性质粒经PvuI单酶切线性化
后与植物表达载体pMDC43质粒进行LR重组反应，转化，提取阳性质粒，植物表达载体
pMDC43-CmTCP20构建成功；所述的引物序列如下：
上游引物CmTCP20-GATE-F：5′-CGCGGATCCGGATGACTGATCCCAACACC-3′(SEQ
IDNO.4)，
下游引物CmTCP20-GATE-R：5′-TTGCGGCCGCGACTGACCCTCTGAACCTCG-3′
(SEQIDNO.5)；
(3)采用农杆菌介导法将步骤(2)获得的CmTCP20基因植物表达载体导入菊花，经

\t过潮霉素抗性筛选得到阳性转化植株，对阳性转化植株进行PCR、定量RT-PCR检测验证内
源基因已经转入转基因植株的基因组DNA中并发...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈发棣，王晶晶，王海滨，宋爱萍，蒋甲福，陈素梅，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32