一种用于防治作物黄萎病的多粘类芽孢杆菌及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种防治作物黄萎病的多粘类芽孢杆菌及其应用，该菌株被命名为多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)SX-3，保藏号为CGMCC 11638。本发明专利技术提供了一种含有所述多粘类芽孢杆菌的菌剂。本发明专利技术菌株对大丽轮枝菌孢子萌发及菌丝生长都有抑制效果，具有高效拮抗作用。本发明专利技术菌株能用于大丽轮枝菌引起的作物黄萎病的防治，对棉花黄萎病有显著防治效果，盆栽试验防效达到86％以上；且作物发病后期，用包含有本发明专利技术菌株的菌液灌根，仍具有明显的治疗效果，所以，本发明专利技术菌株作为生物农药应用具有很大的潜力。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于微生物种质资源的开发与利用领域，具体涉及一种用于防治大丽轮枝菌引起的作物黄萎病的多粘类芽孢杆菌及其应用。
技术介绍
大丽轮枝菌(Verticilliumdahliae)属于子囊菌门真菌，主要以微菌核在土壤、病残组织、带菌的种子和未经腐熟的土杂肥上越冬，可为害38科660种植物，其中大田作物包括棉花、向日葵、茄子、辣椒、番茄、烟草、马铃薯等，引起的病害称为黄萎病。越冬后的微菌核萌发，产生大量的分生孢子，分生孢子萌发侵入根毛、根表皮细胞或根部伤口，经过皮层进入导管，破坏植物的维管束系统，并在侵染过程中产生毒素，导致作物萎蔫死亡给农业生产带来严重损失。病原菌产生的黑色微菌核具有抗逆性，且具有积累效应，可在土壤中可存活多年，而引起的作物黄萎病是生产中最难防治的病害之一。长期以来，农业生产中防治黄萎病主要以培育抗病品种和使用化学杀菌剂为主，但针对大丽轮枝菌的作物抗病性几乎没有获得完全抗病的品种。主要原因是大丽轮枝菌易变异，新培育的抗病品种很快丧失了抗病性。生产上主要依赖化学杀菌剂，而大量使用化学药剂对人类健康潜在的危害、对食品和环境的污染、对非靶标生物的影响以及导致病原菌抗药性的加速发展等问题已经引起社会的日益关注，减量使用化学农药是发展的必然趋势。随着随经济的发展和人类生活质量的提高，对农产品安全和农业的可持续发展越来越关注，这也促使了生物防治的发展。几年来国内外大量研究表明，利用拮抗微生物研发生防制剂，具有广阔的前景。一方面，微生物种群丰富，而且可通过生物工程技术大幅度提高目标活性物质的产量，易于实现工业化生产；另一方面，微生物制剂本身来源于自然界，易于降解，对环境友好、安全，已有大量的生防产品应用于植物病害防治。在病害防治中，研究集中于芽孢杆菌研发和利用。这是因为芽孢杆菌能分泌多种拮抗化合物，能有效抑制多种植物病原菌。由于这类细菌拥有芽孢，它们对辐射、热、干燥、极端pH值和一些有毒化学物品等有很强的抵抗能力，在一定条件下，内生芽孢在休眠状态下可以保持活力数年至数十年之久；同时，内生芽孢繁殖速度快、营养要求简单和易于在植物根圈定殖的特点，因而利用这些细菌研发的生防制剂已被广泛应用于植物病害的防治方面。我国芽孢杆菌BI30制成的泥炭制剂对生姜青枯病以及枯草芽孢杆菌TG26对烟草青枯病防效达90％以上。多粘类芽孢杆菌属芽孢杆菌类，其拮抗机制主要是分泌的拮抗化合物、溶菌酶等。然而，不同的种类，甚至同种的不同来源株系间的拮抗效果差异很大。虽然国内外都已有多粘类芽孢杆菌制剂，但由于菌株的多样性，不同多粘类芽孢杆菌菌株仍具有不同的抗菌谱、抗菌活性和抗菌特点，筛选不同作用对象的高效菌株仍是现在乃至今后相对长的一段时间内各国科研工作关注的方向。
技术实现思路
本专利技术提供了一种防治作物黄萎病的多粘类芽孢杆菌，该菌株对大丽轮枝菌引起的棉花黄萎病的防效达86％以上。一种多粘类芽孢杆菌，分类命名为多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa)SX-3，保藏于位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，保藏日期为2015年11月11日，保藏号为：CGMCCNo.11638。该菌株主要形态及生物学特征为：革兰氏染色反应阳性，菌体杆状，无鞭毛，大小约为0.58μm×2.9μm，菌落表面光滑，呈乳白色。该菌株16SrDNA序列分析显示其与GenBank号为JX849658.1或KR010176.1的多粘类芽孢杆菌(Paenibacilluspolymyxa)一致性为99％。本专利技术提供了一种含有所述多粘类芽孢杆菌的菌剂，该菌剂的浓度优选为1×107～1×108CFU/mL，更优选为1×108CFU/mL。本专利技术提供了所述菌剂的制备方法，包括：将所述多粘类芽孢杆菌接种于培养液中，培养至OD600为0.6～0.8，获得种子液；所述培养液可选用LB液体培养基，其配方为：胰蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，氯化钠10g/L，调节pH为7.0～7.2。将种子液接种于发酵培养基中扩大培养，调节发酵液中多粘类芽孢杆菌的浓度至1×107～1×108CFU/mL，即获得所述菌剂。其中，所述种子液的接种量优选为1～2％；所述发酵培养基为：先将淀粉糊化，再加入到含有酵母粉、蛋白粉、葡萄糖、MgSO4、KH2PO4、CaCO3的培养基中，121℃灭菌30分钟。本专利技术中，所述扩大培养是在发酵罐中进行，培养本专利技术菌株时的温度、pH、通气量、罐压、转速等条件没有特别严格的要求，只要该条件适合所述菌生长即可。在一些较佳实施方案中，通气比为0.4～2∶1，转速为300～800rpm，pH宜在6～7.5之间，培养温度宜在28～35℃之间，培养时间在48～72h之间。最终菌浓度通常可达1×1010～1×1011CFU/mL，调节菌悬液浓度至1×107～1×108CFU/mL施用。本专利技术提供了所述多粘类芽孢杆菌在拮抗大丽轮枝菌中的应用。在平板拮抗试验中，本专利技术菌株对大丽轮枝菌孢子萌发的抑菌圈直径为4.2cm，对菌丝生长的抑制率达75％，菌丝被抑制后不能形成轮枝，出现明显的膨大、消解等畸形现象。本专利技术提供了所述多粘类芽孢杆菌在防治作物黄萎病中的应用。所述作物可以是棉花、向日葵、茄子、番茄、烟草或马铃薯，优选为棉花。防治棉花黄萎病可以按如下方法操作：在棉花3～4叶期，将所述菌剂浇在苗床上或对植株灌根处理，防治5天后接种大丽轮枝菌，接种20天后，防效仍达86％以上；或将所述菌剂灌根于已发病植株，一周后，病株茎基部维管束变褐症状消失。本专利技术多粘类芽孢杆菌对大丽轮枝菌具有高效拮抗作用，能用于大丽轮枝菌引起的作物黄萎病的防治，棉花盆栽试验防效达86％以上；且作物发病后期，用包含有本专利技术菌株的菌液灌根，仍具有明显的治疗效果，所以，本专利技术菌株作为生物农药应用具有很大的潜力。附图说明图1为本专利技术多粘类芽孢杆菌的菌落特征图；图2为本专利技术多粘类芽孢杆菌的电镜图；图3为本专利技术多粘类芽孢杆菌对大丽轮枝菌的分生孢子抑制作用图，左边实验组，右边为对照组；图4为本专利技术多粘类芽孢杆菌对大丽轮枝菌菌丝的抑制作用图，左边为实验组，右边为对照组；图5为大丽轮枝菌菌丝生长被本专利技术多粘类芽孢杆菌抑制后的显微观察图；图6为大丽轮枝菌菌丝生长被本专利技术多粘类芽孢杆菌抑制后的显微观察图。具体实施方式实施例1菌株分离筛选供试土样采自河北农科院连作的棉花病苗圃和陕西省三元县西北农林科技大学连作的棉花试验田中，随机采集土样于无菌袋中，密封后于4℃冰箱中保存。双层平板法筛选土壤中的生防细菌。将培养4-5天的大丽轮枝菌打菌饼于无菌水中，配制浓度为106个/mL的孢子悬浮液。取适量(1g)土样于无菌水中配制成土壤悬浮液，系列稀释至10-2-10-3。双层平板法：将配制的大丽轮枝菌孢子悬浮液均匀涂布PDA上，28℃下生长48h后，倒LB于PDA上层，均匀涂布土壤悬浮液。将平板置本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种多粘类芽孢杆菌，其特征在于，命名为多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)SX‑3，保藏号为：CGMCC 11638。

【技术特征摘要】
1.一种多粘类芽孢杆菌，其特征在于，命名为多粘类芽孢杆菌
(Paenibacilluspolymyxa)SX-3，保藏号为：CGMCC11638。
2.一种包含如权利要求1所述多粘类芽孢杆菌的菌剂。
3.如权利要求2所述的菌剂，其特征在于，所述多粘类芽孢杆菌的
浓度优选为1×107～1×108CFU/mL。
4.如权利要求1所述的多粘类芽孢杆菌在拮抗大丽轮枝菌中的应用。
5.如权利要求1所述的多粘...

【专利技术属性】
技术研发人员：张敬泽，李晓林，祝水金，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33