一种制备转GAPDH基因棉花的方法技术

本发明专利技术公开了一种制备转GAPDH基因棉花的方法。GAPDH蛋白，为如下（1）或（2）所示：（1）SEQ?ID?No.2所示的蛋白；（2）将SEQ?ID?No.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且功能相同的蛋白质。本发明专利技术首次获得了转GAPDH基因棉花，为培育耐盐碱棉花品种及提高棉花的耐盐碱能力奠定了基础，具有一定的经济和社会效益。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了一种制备转GAPDH基因棉花的方法。GAPDH蛋白，为如下（1）或（2）所示：（1）SEQ?ID?No.2所示的蛋白；（2）将SEQ?ID?No.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且功能相同的蛋白质。本专利技术首次获得了转GAPDH基因棉花，为培育耐盐碱棉花品种及提高棉花的耐盐碱能力奠定了基础，具有一定的经济和社会效益。【专利说明】—种制备转GAPDH基因棉花的方法
本专利技术涉及一种制备转GAPDH基因棉花的方法。
技术介绍
土壤盐溃化是一个全球性生态问题，是当今世界土地荒漠化和耕地退化的主要因素之一，土地的盐溃化对农业生产和生态环境带来的影响巨大。如何开发利用盐碱地成为日益关注的焦点。土壤中高浓度的盐分会造成植物体内离子失衡、氧化伤害、水分亏缺和营养缺乏并导致生物大分子破坏、生长迟缓、甚至植株死亡，严重影响着植物的生长发育，从而导致作物的减产或绝收，制约农业生产和发展。具体盐胁迫对植物的影响表现在:对种子萌发的影响，对植物光合作用、呼吸作用、蛋白质合成及新陈代谢等的影响，对植物形态的影响等。目前，利用转基因技术培育耐旱、耐盐碱的作物新种质已成为作物育种家的研究重点。植物耐盐是一个多基因参与控制的数量性状、多途径诱导的过程。植物适应盐胁迫的对策中较为普遍的是代谢调整。在胁迫条件下，植物本身能够感知和传导逆境胁迫信号，进而启动相关基因的表达，激活相应的保护代谢途径，如抗氧化酶系与活性氧的清除，离子、代谢物的积累与渗透调节，胁迫诱导蛋白的合成及其防御功能，胁迫诱导基因的调控与表达。此外，植物还会通过泌盐作用、稀盐作用、拒盐作用等过程来抵抗盐胁迫。随着生物科技技术的不断发展，以及生理学，遗传学，分子生物学对抗逆性复杂机制的阐述，对植物耐盐研究已经取得了一些重大成果，已经发现了很多耐盐相关基因，但是由于其机制复杂性还有很多与抗盐相关的基因未被发现。 自然界中存在着许多天然的耐盐植物，它们在漫长的进化过程中积累了很多丰富的耐盐基因。杜氏盐藻、红树、滨黎、海带、圣柳、蒺藜苜蓿、碱蓬、大米草等耐盐植物自身具有一套完善的耐盐机制。目前国内外许多实验室在植物耐盐基因研究方面做了大量工作，发现在盐胁迫条件下，植物会特异地表达一些基因，在一定程度上提高了植物的抗逆能力。利用基因工程手段和分子生物学的方法克隆耐盐相关基因，转化棉花，大豆，小麦和玉米等重要经济作物，获得能在盐碱地上种植和栽培的农作物品种是未来研究的重点课题。通过研究这些被盐胁迫所表达的基因，可能找到植物对盐胁迫的适应及抵御机理，也为研究转基因方面提供很好的理论依据。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种制备转GAPDH基因棉花的方法。本专利技术所提供的GAPDH蛋白，为如下(I)或(2)所示:(I) SEQ ID N0.2 所示的蛋白；(2)将SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且功能相同的蛋白质。上述蛋白的编码基因也属于本专利技术的保护范围。上述编码基因为如下中至少一种:I) SEQ ID N0.1 所示的 DNA 分子；2)在严格条件下与I)限定的DNA分子杂交且编码上述蛋白质的DNA分子；3)与I)或2)限定的DNA分子具有90%以上的同一性且编码上述蛋白质的DNA分子。含有上述任一所述的编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也属于本专利技术的保护范围。 一种制备转GAPDH基因棉花的方法也属于本专利技术的保护范围，该方法包括如下步骤:将上述任一所述的编码基因导入出发棉花中，得到转基因棉花；与出发棉花相比，转基因棉花的耐盐性增强。上述方法中，所述编码基因是通过重组表达载体导入的，所述重组表达载体是将所述编码基因插入出发载体PBI121的多克隆位点得到的。上述任一所述的方法中，所述编码基因通过基因枪活体转化的方法导入；和/或，所述转基因棉花的耐盐性增强是指转基因棉花的种子在0.8% (质量百分含量)NaCl水溶液条件下的发芽率高于出发棉花的种子在0.8% (质量百分含量)NaCl水溶液条件下的发芽率。上述蛋白、上述任一所述的编码基因在提高棉花耐盐性中的应用也属于本专利技术的保护范围；所述的耐盐性为耐0.8% (质量百分含量)NaCl水溶液的性质；所述提高棉花耐盐性是指棉花的种子在0.8% (质量百分含量)NaCl水溶液条件下的发芽率提高。本专利技术首次获得了转GAPDH基因棉花，为培育耐盐碱棉花品种及提高棉花的耐盐碱能力奠定了基础，具有一定的经济和社会效益。【专利附图】【附图说明】图1为杜氏盐藻甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(GAPDH)的克隆。图2为基因枪大田转化流程图。图3为转基因棉花桃。图4为GAPDH基因分子检测结果(以Fl和Rl为引物)。图5为GAPDH基因分子检测结果(以F2和R2为引物)。图6为种子7天后的发牙结果。【具体实施方式】下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。杜氏盐藻在文献“刘建国，吴超元.杜氏盐藻和β_胡萝卜素研究评价.海洋与湖泊，1995，26(3):323-330.”中公开过，公众可从中国农业科学院棉花研究所抗逆鉴定课题组实验室获得。pGEM-T EasyT4载体购自Promega公司，产品目录号为A1380。pBI121在文献“香蕉Maasrl基因RNAi植物表达载体的构建及鉴定.热带作物学报，2009年，30 (3):333-337.”中公开过，公众可从中国农业科学院棉花研究所抗逆鉴定课题组实验室获得。基因枪为美国wealtec的基因枪⑶S-80。 非抗虫棉花材料沪749513在文献“高频体细胞胚胎发生的优异棉花种质材料筛选.分子植物育种，2012,10 (6), 683-688.”中公开过,公众可从中国农业科学院棉花研究所抗逆鉴定课题组实验室获得。实施例1、GAPDH超表达载体的构建一、设计PCR引物引物序列如下:GAPDH-F:5，-ATGGCTACATCAATGGCGAAGAC-3，；GAPDH-R: 5，-TTAGGCGGCCCACCTCTGGGCG-3，。二、PCR 扩增(一)提取杜氏盐藻的RNA，反转录成cDNA。(二)以cDNA为模板，用弓丨物对GAPDH-F/GAPDH-R进行GAPDH基因的PCR扩增。PCR扩增体系为: Premix Ex Tag25 μ I 模板2.0 μ IGAPDH-F (10 μ Μ) 2.0μ IGAPDH-R (10μ Μ) 2.Ομ IddH20补足至总体积50 μ I。PCR反应程序如下:94°C 3min ；94°C 30s, 58°C 30s, 72°C 90s, 35 个循环；72°C IOmin ；4°C + ⑴。GAPDH基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。GAPDH蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。三、琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增片段并回收。琼脂糖凝胶电泳检测结果如图1所示。图1 中，I:PCR 扩增产物；2 =Marker0图1表明，PCR扩增得到的GAPDH基因片段与预计大小一致。四、将GAPDH基因片段与pGEM-T EasyT4载体连接，得到本文档来自技高网...

【技术保护点】
GAPDH蛋白，为如下（1）或（2）所示：（1）SEQ?ID?No.2所示的蛋白；（2）将SEQ?ID?No.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且功能相同的蛋白质。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：叶武威，阴祖军，孔静静，王德龙，王俊娟，樊伟莉，王帅，
申请(专利权)人：中国农业科学院棉花研究所，
类型：发明
国别省市：