一种获得转基因棉花的方法技术

本发明专利技术公开了一种获得转基因棉花的方法。本发明专利技术的方法包括如下步骤：（１）切除棉花子叶苗的子叶、叶柄和部分下胚轴，下胚轴保留１－３ｃｍ，得到待侵染组织；２５－３０℃、相对湿度４０％－６０％、暗培养２－３天；（２）从茎尖顶部至下胚轴基部双面划伤，伤口深０．８－１．２ｍｍ；（３）在溶液Ａ中浸染１５－４５分钟；溶液Ａ中含携带外源基因的重组农杆菌；（４）共培养２－４天，然后进行抗性筛选，得到抗性棉花苗；（５）将抗性棉花苗嫁接在棉花砧木上，得到转基因棉花。本发明专利技术通过调整茎尖生长状态、确定农杆菌转化的茎尖侵染合适深度、加入乙酰丁香酮并调整适宜的ｐＨ值，提高转化效率。利用本发明专利技术的方法可以快速获得转基因植株且具有较高的转基因效率。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于植物转基因
，涉及，具体涉及一 种以棉花茎尖为受体、通过农杆菌介导获得转基因棉花植株的新方法。
技术介绍
棉花是一种重要的经济作物，在国民经济中占有重要地位。棉花转基因技术在遗 传改良方面已取得重大进展，成为生物技术在作物遗传改良中成功应用的范例。目前，转基 因植物的遗传转化方法以农杆菌介导转化法应用最为广泛。由农杆菌介导基因转化技术 具有不受季节限制、目的基因多为单拷贝或低拷贝、插入边界多为T-DNA左右边界，重排率 低、容易排除冗余的质粒DNA序列、容易获得无选择标记的转基因植株等优点而倍受青睐。 自从1987年Umbeck等首次报道了通过农杆菌介导法将NPT II基因导入棉花，1994年陈志 贤等也利用此法获得导入2，4-D抗性基因的陆地棉植株，随之Bt基因、CPTI基因也相继导 入棉花，这种由农杆菌介导基因转化技术迅速发展起来。根据棉花遗传转化受体的类型，棉花以农杆菌介导的细胞核遗传转化主要技术体 系有以胚性愈伤组织为受体的转化体系、以下胚轴为受体的转化体系、以茎尖分生组织为 受体的转化体系。以胚性愈伤组织和下胚轴为受体的两种转化体系都必须要经过体细胞胚 胎发生和植株再生，由于在诱导愈伤组织过程中要经过分化、再分化过程，能产生很多遗传 变异和体细胞变异，植株再生困难，转化周期长，目前报道最短的植株再生所用的时间在五 个月以上；基因型对棉花体细胞胚胎发生和植株再生具有决定性作用，同一棉属不同棉种 之间、同一棉种不同品种之间体细胞胚胎发生和植株再生的能力不同，只有少数品种离体 培养的材料可以诱导出胚性愈伤组织，限制了遗传转化的品种范围。以茎尖分生组织为受体的农杆菌转化法不经过脱分化、再分化过程，遗传变异和 体细胞变异程度低；受棉花基因型限制的影响较小，许多未能实现体细胞胚胎发生和植株 再生的棉花品种也可以成功进行遗传转化。自从Renfroe等报道利用棉花茎尖分生组织获 得再生植株以来，国内外很多学者都利用茎尖或茎尖分生组织获得了转基因再生植株。但 通常转化率低，且由于不定芽起源于多细胞，嵌合体比较多等因素的限制影响再生苗的获 得。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供。本专利技术提供的获得转基因棉花的方法，包括如下步骤(1)切除棉花子叶苗的子叶、叶柄和部分下胚轴，下胚轴保留0.8-3cm的长度 (可为 0. 8-2cm,如 0. 8-1. 5cm, 1. 5_2cm)，得到待侵染组织；然后 25-30 °C (如 25-28 °C， 28-30°C )、相对湿度 40% -60% (如 40%-50%, 50%-60% ),暗培养 2-3 天(如 2-2. 5 天， 2. 5-3天)；所述子叶苗为子叶半展开、下胚轴伸长至4-6cm(如4-5cm，5-6cm)的无菌苗；(2)将暗培养后的待侵染组织双面划伤，划伤范围为从茎尖顶部至下胚轴基部，伤4口深 0. 8-1. 2mm(如 0. 8-lmm, 1-1. 2mm)；(3)将划伤的待侵染组织在溶液A中浸染15-45分钟(如15_30分钟，30-35分 钟)；所述溶液A中含有携带外源基因的重组农杆菌；(4)侵染完成后共培养2-4天(如2-3天，3-4天)，然后进行抗性筛选，得到抗性 棉花苗；(5)将抗性棉花苗嫁接在棉花砧木上，得到转基因棉花。相对湿度，表示空气中的绝对湿度与同温度下的饱和绝对湿度的比值，得数是一 个百分比(也就是指在一定时间内，某处空气中所含水汽量与该气温下饱和水汽量的百分 比)。步骤(3)中，所述溶液A的pH为5.3-5. 8(如5.3-5.6,5. 6-5. 8)，由溶质和水 组成；所述溶液A的溶质及其浓度如下乙酰丁香酮40-120 ill L—1 (如40-80 u 1 80-120 u 1 I71)，2-N-吗啉乙烷磺酸(MES)65-85mM(如 65_75mM，75_85mM)、葡萄糖 2-3 % (w/w,质量百分含量)(如 2-2. 5 %，2. 5-3 % )、激动素(KT) 0. 08-0. 12mg L—1 (如 0. 08-0. lmg lAO. 1-0. 12mg L—1)、含有外源基因的重组农杆菌 OD600 = 0. 6-0. 8。步骤(4)中，所述抗性筛选可在筛选培养基上进行。所述筛选培养基具体可由MS 基本培养液、琼脂、甘氨酸、激动素(KT)、卡那霉素(Kan)和头孢霉素(Cef)组成；筛选培养 基中，琼脂的终浓度为7. 5g化―1，甘氨酸的终浓度为2mg化―1，激动素的终浓度为0. lmg 卡那霉素的终浓度为50-100mg L-1 (如50-75mg L-1，75-100mg L-1)，头孢霉素的终浓度 为 250-500mg I71 (如 250_375mg L-1，375_500mg 。步骤(4)中，所述共培养可在共培养基上进行。所述共培养基具体可由MS基本培 养液、琼脂、甘氨酸和激动素组成；共培养基中，琼脂的终浓度为7. 5g ^―1，甘氨酸的终浓度 为2mg L—1，激动素的终浓度为0. lmg L—1。所述MS基本培养液的溶剂是水、具体溶质可如表1所示。表1 MS基本培养液的溶质大量元素培养基中浓度(g L—1)nh4no31. 65kno31. 9kh2po40. 17MgS04 7H200. 37CaCl20. 44微量元素培养基中浓度(mg L—1)5<table>table see original document page 6</column></row><table>所述外源基因具体可为抗虫基因Cry2A\ AGP启动子或GFP基因；所述抗虫基因 Cry2A*的核苷酸序列如序列表的序列1所示；所述AGP启动子的核苷酸序列如序列表的序 列2所示；所述GFP基因的核苷酸序列如序列表的序列3所示。所述重组农杆菌可为用携带所述外源基因的重组质粒转化农杆菌得到的重组农 杆菌。所述重组农杆菌具体可为如下(a)或(b)或(c)(a)用重组质粒pTiB0542转化农杆菌EHA105得到重组农杆菌；(b)用重组质粒pBI a⑶S转化农杆菌EHA105得到重组农杆菌；所述重组质粒 pBI a GUS是将pBI121的HindHI和Xba I酶切识别位点之间的小片段取代为序列2所示 的DNA得到的重组质粒；(c)用重组质粒pBI a GFP转化农杆菌LBA4404得到重组农杆菌；所述重组质粒 pBI a GFP是将pBI a⑶S的Xba I和Sac I酶切识别位点之间的小片段取代为序列3所示 的DNA得到的重组质粒。所述棉花具体可为棉花品种冀丰197或棉花品种鄂抗棉12。以上任一所述方法在可应用于棉花育种。本专利技术针对目前棉花遗传转化中植株再生困难、遗传变异率高、基因型限制性强 和转化周期长，提出一种以棉花茎尖为受体通过农杆菌介导棉花遗传转化的新方法。该方 法通过调整茎尖生长状态、确定农杆菌转化的茎尖侵染合适深度、加入乙酰丁香酮并调整 适宜的PH值，提高转化效率。利用本专利技术的方法可以快速获得转基因植株且具有较高的转 基因效率。具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种获得转基因棉花的方法，包括如下步骤：　　（１）切除棉花子叶苗的子叶、叶柄和部分下胚轴，下胚轴保留０．８－３ｃｍ的长度，得到待侵染组织；然后２５－３０℃、相对湿度４０％－６０％、暗培养２－３天；所述子叶苗为子叶半展开、下胚轴伸长至４－６ｃｍ的无菌苗；　　（２）将暗培养后的待侵染组织双面划伤，划伤范围为从茎尖顶部至下胚轴基部，伤口深０．８－１．２ｍｍ；　　（３）将划伤的待侵染组织在溶液Ａ中浸染１５－４５分钟；所述溶液Ａ中含有携带外源基因的重组农杆菌；　　（４）侵染完成后共培养２－４天，然后进行抗性筛选，得到抗性棉花苗；　　（５）将抗性棉花苗嫁接在棉花砧木上，得到转基因棉花。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：华金平，刘正杰，王彦霞，熊敏，王玉美，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]