棉花GhMTT8a基因的功能并利用生物技术手段在改良棕色纤维棉中的应用制造技术

本发明专利技术涉及一种利用生物技术手段改良棉花棕色纤维色泽的方法，尤其涉及一种利用棉花基因及其构建的植物表达双元载体采用棉花转基因技术进行在改良棉花棕色纤维色泽中的应用。一种由棉花GhTT8A基因编码的蛋白质，该蛋白质的氨基酸序列如SEQID：NO.2所示。棉花GhTT8A基因的植物正义互补双元表达载体，该表达载体以植物表达双元载体pFGC5941为骨架载体，选取含有GhTT8a基因完整蛋白质编码框的一段序列作为该基因的正义表达结构，并分别引入BamHI和XhoI酶切位点，从而构建了含有GhTT8a基因的正义表达载体。

【技术实现步骤摘要】
棉花GhTT8A基因的功能并利用生物技术手段在改良棕色纤维棉中的应用
本专利技术涉及一种利用生物技术手段改良棉花棕色纤维色泽的方法，尤其涉及一种利用棉花基因及其构建的植物表达双元载体采用棉花转基因技术进行在改良棉花棕色纤维色泽中的应用。
技术介绍
天然彩色棉是一种棉纤维具有自然色彩的特殊类型棉花，因其具有独特的自然色彩，在纺织及加工过程中无需漂染，对人类和环境无污染、穿着舒适，特别适合制作贴身衣物，是真正的“生态”、“环保”棉，从而引起国内外棉花育种家和纺织、服装工业界的广泛关注，被誉为21世纪国际市场最具潜力的生态纺织品。中国彩色棉的研究与开发虽起步较迟，但发展很快。从1998年到2010年，中国天然彩色棉种植面积从每年1万亩扩大到每年20多万亩，皮棉产量从每年800吨增加到每年2万多吨，10年间，彩棉种植面积和皮棉产量分别增长了20倍和25倍。彩色棉主要有棕色和绿色两大系列色彩，在彩色棉新品种选育方面，借助于常规育种技术，世界各国和我国一些育种单位纷纷开展研究并选育出一批彩色棉新品种，在一定程度上改善了彩色棉的品质和性状。国内各研究单位选育出的彩色棉品种有：新彩棉系列品种(1号至20号)、中棉所51、浙彩棉2号、苏彩杂1号等品种。与白棉花相比，彩色棉品种依然存在着以下突出问题：纤维比强度不高，纤维长度偏短、衣分偏低，色素稳定性差，色彩单一，从而限制了棕色棉在纺织工业中的应用。因此，创新彩色棉的纤维色泽并提高棕色棉的纤维强度、纤维长度是关系到我国纺织工业和彩色棉产业发展兴衰成败的两个关键因素，也是广大棉花育种科研工作者面临的一个重要课题。在自然界中，植物色素可分为光合色素(如叶绿素)和非光合色素(如类黄酮和类胡萝卜素)。研究表明，天然彩色棉纤维色素属于非光合色素，并且与棉纤维发育的特定时期有关。国内外学者通过对棕色棉纤维色素形成过程及生化特征本质的研究，初步认为存在以下2种推测：(1)Ryser、Xiao和詹等推测认为天然棕色棉纤维色素最初来源是位于液泡里的儿茶素衍化形成的原花色素(Proanthocyanidins)，也称为缩合单宁(CondensedTannins)，并由缩合单宁接触空气氧化而形成具有棕色的醌类化合物；(2)赵等认为棕色棉纤维色素属于类黄酮化合物。而且，Xiao和詹的实验都证实棕色棉纤维色素的前体物质属于原花色素(缩合单宁)。詹等对棕色棉、白棉纤维和种皮中分布的色素含量进行了分析，研究认为：决定纤维颜色的主要原因是色素在纤维和种皮之间的分配比例。棉纤维是由种皮细胞分化而来，棉纤维的形成过程与种皮细胞的发育关系密切。拟南芥、棉花同属于双子叶植物，了解拟南芥种皮色素的合成代谢及调控途径对于揭示棉花种皮棕色素、棉纤维棕色素发育、纤维与色素的共沉积分子机理具有重要理论意义。拟南芥种皮色素的合成代谢途径受到多种基因的调控，属于植物次生代谢。通过对拟南芥种皮Transparenttesta系列突变体的研究表明：苯丙氨酸(Phenylpropanoid)是形成缩合单宁的最初氨基酸，它在一系列酶的催化作用下，最终形成无色的缩合单宁，再经空气氧化而呈现出种皮的棕色特征。其中，TT4编码查尔酮合酶(CHS，chalconesynthase)，TT5编码查尔酮异构酶(CHI，chalconeisomerase)等作为结构基因编码类黄酮代谢途径中的酶，TT1，TT2，TTG1，TTG2，TT8等作为转录因子对结构基因的转录进行调控，TT8和TT19则编码色素转运蛋白参与类黄酮物质的转运与积累。在棕色棉纤维色素发育的相关研究中，国内外学者采用不同的分子生物学手段，从棉花中克隆了多个与拟南芥种皮色素合成代谢途径相关的同源基因，如GhCHS,GhCHI,GhF3H,GhDFR,GhANS,GhANR等，这些基因参与色素合成的蛋白质功能推测均基于同源序列分析及生物信息学的功能推测，究竟是否同时参与棉花种皮色素、纤维的色素合成代谢有待进一步证实。针对棉花棕色素研究中存在的上述重要理论课题，迫切需要以拟南芥种皮棕色素合成途径相关基因为参照，在棉花中克隆相关同源基因，并通过分子生物学和转基因技术加以功能验证，以明确这些相关基因是否同时参与棉花纤维棕色素的合成。上述问题的研究证实，将为我们进一步开展棕色棉纤维色素合成代谢途径的研究提供理论支持，并通过分子生物学手段改良棕色棉纤维品质、突破棉纤维色泽多样性研究具有重要的理论和实践意义。在植物基因功能研究中，转基因功能互补和基因沉默是揭示基因功能的有效技术手段。功能互补通过构建目的基因的正义表达载体转化该基因缺失突变体，从而验证该基因在植物体内执行的功能。对于同源基因功能的验证，也可以采用转化近似物种的突变体，从而快速完成同源基因的功能验证。对于棉花转基因周期较长、单一性状突变体库缺乏，采用转化拟南芥突变体进行同源基因或相似基因结构域的功能验证是一种比较快捷的方法。基因沉默是生物体的一种古老机制，它在生长和发育过程中通过降解RNA、抑制翻译或修饰染色体等方式发挥作用。近年来，该技术作为一个重要的遗传操作工具在植物分子生物学研究和遗传改良方面得到广泛应用，多种植物基因沉默技术相继建立,包括反义RNA、dsRNAi(双链RNA干涉)和人工microRNA，特别是dsRNAi和microRNA在基因沉默的精确性和高效性等方面有了新突破。dsRNAi和microRNA在降解目标基因mRNA的效率上比反义RNA技术更高，能在低于反义RNA几个数量级的浓度下使目标基因表达降到极低的水平甚至功能完全丧失；而且，在转基因过程中，不存在插入位点随机性的问题，理论上任何基因都可被针对性的dsRNAi或microRNA特异性沉默。
技术实现思路
为了克隆并了解棉花纤维棕色素合成相关基因并进而对棕色棉纤维品质进行改良，利用生物技术等手段实现棉花纤维色泽多样化，本专利技术的第一个目的是提供棉花GhTT8A基因和由该基因编码的蛋白质，并通过实验证明该基因既参与种皮棕色素的形成，又参与纤维棕色素的形成，有望在棕色棉育种上得以应用。本专利技术的第二个目的是提供含有上述的基因的表达载体和宿主细胞。本专利技术的第三个目的是提供上述的基因在改良棉花棕色纤维色泽中的应用。为了实现上述的第一个目的，本专利技术采用了以下的技术方案：一种由棉花GhTT8A基因编码的蛋白质，该蛋白质的氨基酸序列如SEQID：NO.2所示。为了实现上述的第二个目的，本专利技术采用了以下的技术方案：棉花GhTT8A基因的植物正义互补双元表达载体，该表达载体以植物表达双元载体pFGC5941为骨架载体，选取含有GhTT8a基因完整蛋白质编码框的一段序列作为该基因的正义表达结构，并分别引入BamHI和XhoI酶切位点，从而构建了含有GhTT8a基因的正义表达载体。一种宿主细胞，该宿主细胞采用所述的棉花GhTT8A基因的植物正义互补双元表达载体转化。作为优选，所述的转化用的菌株采用农杆菌EHA105。进一步，所述的宿主细胞采用渗透法转化拟南芥突变体tt8。棉花GhTT8a基因的双链RNA干涉表达载体，该表达载体以植物表达双元载体pCAMBia2301为骨架载体，选取植物表达双元载体pBI121的表达核结构，酶切、连接构建成载体pCAMBIA2301-121，再本文档来自技高网...

【技术保护点】
棉花GhTT8A基因，其特征在于：该基因的核苷酸序列如SEQ ID：NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.棉花GhTT8A基因，其特征在于：该基因的核苷酸序列如SEQID：NO.1所示。2.一种蛋白质，其特征...

【专利技术属性】
技术研发人员：李付振，祝水金，邱新棉，吴学龙，王美兴，
申请(专利权)人：浙江省农业科学院，浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33