一种水稻稻瘟病抗性基因RMg37及其应用制造技术

本发明专利技术属于基因工程技术领域，具体涉及一种水稻稻瘟病抗性基因RMg37及其应用。本发明专利技术公开了水稻稻瘟病新抗性基因RMg37的核苷酸序列及其编码的氨基酸多肽序列。此基因为NBS-LRR类型抗病基因家族的成员。本发明专利技术中的抗稻瘟病基因克隆自对稻瘟病菌表现出高抗的水稻品系，并将其转化至对稻瘟病菌感病的品种中，利用稻瘟病菌侵染的方法对其抗病能力进行评估，从而最终确定该基因对水稻稻瘟病具有抗性。

【技术实现步骤摘要】
-种水稻稻瘟病抗性基因 RMg37及其应用
本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种水稻稻瘟病抗性基因 RMg37及其应 用。
技术介绍
稻癌病是由水稻病菌（Magnaporthe oryzae)引起的真菌水稻病害。稻癌病、白叶 枯病以及纹枯病是世界范围内水稻的三大病害，其中稻瘟病是危害最严重的一种。作为世 界性的病害，稻瘟病每年在全球范围内造成水稻产量损失达10%_30%。而在中国，自从20世 纪90年代以来，稻瘟病的年发生面积均在380万公顷（hm2)以上。并且在南北稻区，稻瘟 病的危害最为严重，每年均有不同程度的稻瘟病害发生，重病区严重时甚至会有局部田区 颗粒无收。因此，对稻瘟病防治抵御一直都是研究的热点。但是，常规的化学农药已不能解 决植物病害日趋严重的耐药性，并且农药带来的污染问题也亟需解决。而实践证明，利用水 稻自身所携带的抗病基因培育抗病品种，是最为有效环保的防治和控制稻瘟病害的方法。 植物在长期抵御外界病虫害的过程中演化出了双保险防御体系（Young et al. 2006)。第一层防御体系是通过细胞表面的受体识别一些保守的微生物来源的分子出发的 古老的、普遍的免疫反应。而在第二层防御体系，植物通过具有特异性识别病原菌效应分 子的抗病基因，来抵抗突破第一道防线的病原菌。根据结构特点的不同，抗病基因主要包 括5种类型：NBS-LRR、RLK、RLP、STK及其他类型。含有抗病基因的抗性品种往往产量低、 品质差，而高产或质优品种又无抗性，为了选育集高产，优质和多抗为一体的改良品种，人 们从很早就开始意识到抗病基因的重要性，传统的方法培育抗病品种的方法，通常是将携 带有抗病基因的抗病品种与感病的优质高产的品种杂交，然后不停的回交，达到将抗病基 因引入优质品种，得到高产优质抗病品种的目的。尽管这种方法十分有效，但是这种方 法费事费力，并且通过此种方法选育出来抗病品种只有往往由于周期较长，病菌进化产生 新的株系而造成抗性的丧失。1986年由剑桥大学的Alan Coulson提出由剑桥大学的Alan Coulson提出图位克隆方法大大解决了这个问题，图位克隆是将目标基因定位到染色体的 精确位置，并利用与之紧密连锁的分子标记以及染色体移步筛选到含有该目标基因的亚克 隆，然后通过遗传转化和功能互补实验进行验证。这种方法取得了很好的效果，在植物抗病 基因的克隆中起到了非常重要的作用，但因其周期长、费时费力、分离和等位性检测较难等 原因，不适合大量克隆抗病基因的需要。同时，因抗病基因独特的遗传方式，也使该方法的 应用受到了很大的限制。以水稻抗稻瘟病基因为例，该类基因在基因组中通常成簇（gene cluster)分布，在不同品种的同源染色体间的位置和结构也多呈不对称分布，等位关系不 明确，拷贝数变异大（Yang et al. 2007; Ding et al. 2007a; Sun et al. 2008; Li et al. 2010)。这些遗传现象，大大增加了图位克隆的难度，严重影响了抗病基因的克隆效率。 并且对于应对像稻瘟病这种快速进化的病菌依然存在着育种周期过长的问题。截止到目前 为止，仅有23个抗稻瘟病基因被克隆出来。 而我们通过对植物抗病基因起源、进化及结构功能的研究，发现抗病基因主要为 一类含有LRR的基因，其中NBS-LRR类型是最大的抗病基因家族。而本专利技术就是根据抗病 基因的这一特征，利用分子生物学和生物信息学手段，根据抗病基因的遗传进化特征，筛选 潜在的抗病基因，快速、高效、大量的克隆候选基因，最终在水稻中得到具有水稻稻瘟病抗 性的基因。
技术实现思路
本专利技术的目的是，分离克隆水稻高抗品种中携带的稻瘟病抗性基因 RMg37及包含 调控这基因的启动子的DNA片段。 本专利技术的另一个目的是提供上述稻瘟病抗性基因 RMg37所编码的蛋白质序列。 本专利技术的另一个目的是提供含有上述抗性基因的载体。 本专利技术的另一个目的是提供上述载体转化的转基因植株。 本专利技术的另一个目的是提供上述蛋白质在制备抗稻瘟病菌药物中的应用。 本专利技术涉及克隆和鉴定一种包含RMg37基因的DNA片段，这些基因编码的蛋白能 使水稻对稻瘟病菌所引起的病害产生特异性的抗病反应。其中，所述片段分别如序列表SEQ ID NO: 1所示或者基本上相当于SEQ ID NO: 1所示的DNA序列，或者其功能相当于SEQ ID NO: 1所示序列的亚片段。这些DNA序列都编码一种NBS-LRR类蛋白，其氨基酸序列分别如 SEQ ID NO: 2所示。所分离、克隆的RMg37抗性基因编码NBS-LRR蛋白。他们的蛋白都包含 两个主要的结构域：NBS和LRR区域，RMg37蛋白的C-末端为5个LRR重复。 根据本专利技术提供的RMg37基因序列信息（SEQ ID NO: 1)，本领域技术人员可以通过 以下方法获得与RMg37等同的基因：（1)通过数据库检索获得；（2)以RMg37基因片段为探 针筛选水稻或其它植物的基因组文库或cDNA文库获得；（3)根据RMg37基因序列信息设计 寡核苷酸引物，用PCR扩增的方法从水稻或其它植物的基因组、mRNA和cDNA中获取；（4) 在RMg37基因序列的基础上用基因工程方法改造获得；（5)用化学合成的方法获得该基因。 本专利技术提供的稻瘟病抗性基因 RMg37具有重要的应用价值。将所述的RMg37基因 序列用任何一种转化方法导入水稻或其他植物细胞，可获得表达所述基因的转基因抗病品 种，从而应用于生产。本专利技术所述的基因构建到植物转化载体中，可以对所述基因或其调控 序列适当修饰，也可以用其它启动子取代所述基因原有的启动子，从而拓宽抗谱或增强抗 性。 本专利技术具有如下有益效果：将克隆的抗稻瘟病基因转入感病的植物中，有助于获 得新的抗病植物。克隆的抗病基因能在不同的物种间转移并利用，从而能够克服传统抗病 育种中远缘杂交的困难。此外，可以用转基因技术在植物中累加多个抗病基因，缩短育种周 期。本专利技术还能够进一步提供或应用上述DNA片段获得的抗病转基因植株和相应的种子， 以及用本专利技术的基因或基于该基因的重组体转化的植株或由这类植株获得的种子。可以用 有性杂交的方式将本专利技术的基因转入其他植株。 【附图说明】 图1为本专利技术流程示意图。图IA :抗稻瘟病候选位点的确定；图IB-E :抗稻瘟病 基因的分离与克隆；图IF-G :抗稻瘟病基因的遗传转化；图IH :转化体的鉴定。 图2为稻瘟病抗性基因 RMg37的转化体的潮霉素抗性基因和CaMV 35S启动子的 PCR检测电泳图；图IA为CaMV 35S启动子的PCR扩增产物，泳道1-6为转化体的PCR扩增 产物，泳道7为载体pCAMBIA1300-AscI质粒的PCR扩增产物，泳道8为受体新2号的非转 化体的PCR扩增产物；图IB为潮霉素抗性基因的PCR产物，泳道1-6为转化体的PCR扩增 产物，泳道7为载体pCAMBIA1300-AscI质粒的PCR扩增产物，泳道8为受体新2号的非转 化体的PCR扩增产物。 图3为转化有RMg37基因植株抗性鉴定图。图3A :对照植株新2号的抗性鉴定本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种水稻抗稻瘟病基因RMg37，其核苷酸序列为如SEQ ID NO:1所示的DNA序列，或者其核苷酸序列是与SEQ ID NO:1所示的DNA序列在相似度上≥95%相似的DNA序列，或其核苷酸序列的功能相当于SEQ ID NO:1所示DNA序列的亚片段，或者如SEQ ID NO:1所示的DNA序列经过替换、缺失或增加一个或多个核苷酸且编码相同氨基酸序列的核苷酸序列。

【技术特征摘要】
1. 一种水稻抗稻瘟病基因 RMg37,其核苷酸序列为如SEQ ID N0:1所示的DNA序列，或 者其核苷酸序列是与SEQ ID NO: 1所示的DNA序列在相似度上>95%相似的DNA序列，或 其核苷酸序列的功能相当于SEQ ID NO: 1所示DNA序列的亚片段，或者如SEQ ID NO: 1所 示的DNA序列经过替换、缺失或增加一个或多个核苷酸且编码相同氨基酸序列的核苷酸序 列。2. 根据权利要求1所述基因序列编码的蛋白。3. 根据权利要求2所述的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，或SEQ ID NO:2 所示的序列经过替换、缺失、或添加部分氨...

【专利技术属性】
技术研发人员：田大成，司伟娜，张小辉，杨四海，
申请(专利权)人：南京大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32