【技术实现步骤摘要】
技术介绍
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技术介绍
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1、紫菜(pyropia)是世界上最重要的栽培海藻之一，主要产于中国、日本和韩国。其主要分布在潮间带，并形成了对潮汐所带来的周期性失水、高光、高盐等极端胁迫条件的适应性，成为研究潮间带逆境适应的独特材料良代表材料(blouin et al.，2011；zhao etal.，2022)。紫菜需要有精细的光保护机制来消除多余光照带来的影响，避免对其生长发育造成不可逆的损害，研究表明，最为迅速且高效的一种途径是依赖于叶黄素类色素以及相关的叶黄素循环诱导产生的非光化学猝灭(npq)(dautermann and lohr，2017；leonelliet al.，2017)。
2、类胡萝卜素(carotenoids)是重要的天然色素，广泛分布于光合自养生物(如蓝细菌、藻类、维管植物等)以及部分细菌和真菌。在植物中，类胡萝卜素不仅在光合作用中参与捕光，而且起着重要的光保护作用(niyogi and truong，2013)。同时，类胡萝卜素也是植物激素脱落酸和独脚金内酯的合成前体(a1-babili and bouwmeester，2015)。此外，很多类胡萝卜素还是人体所必需的营养物质，作为维生素a的前体和重要的抗氧化成分，类胡萝卜素对于心血管疾病和一些与衰老相关的眼科疾病都具有重要的预防作用(rao and rao，2007；terao，2023)。针对高等植物的研究表明，类胡萝卜素的代谢起始于八氢番茄红素(phytoene)的合成，经过相关代谢酶的一系列脱氢和异构，形成线性的全反式番
3、由紫菜的类胡萝卜素成分分析表明，主要包括叶黄素(lutein)、玉米黄素(zeaxanthin)、α-胡萝卜素、β-胡萝卜素及微量的花药黄素(antheraxanthin)。红藻中参与类胡萝卜素合成的酶基因已经进行了较为全面的克隆鉴定工作(yang et al.，2014；yanget al.，2016；cao et al.，2017；dautermann and lohr，2017；deng et al.，2020)，但尚未有任何关于胡萝卜素ε-羟化酶(chye)的报道。对红藻中chye的发现和功能鉴定不仅有利于阐明类胡萝卜素代谢途径在高光胁迫下的响应机制，了解红藻适应潮间带极端逆境胁迫的部分分子机制，还有利于未来利用基因工程技术提高紫菜中叶黄素等类胡萝卜素的含量来提高紫菜的营养价值，并且通过提高萜类物质的含量改善紫菜的口感和风味，从而整体上提高紫菜的经济价值。
技术实现思路
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技术实现思路
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1、本专利技术提供了一种紫菜胡萝卜素羟化酶基因pucyp97b29及其编码蛋白和应用，该基因转录编码胡萝卜素羟化酶puchy，从而使紫菜中能够合成并积累玉米黄素，叶黄素等类胡萝卜素。
2、本专利技术的一种来源于脐形紫菜的基因pucyp97b29，它的核苷酸序列如序列表seqid no：1所示。
3、本专利技术的一种来源于脐形紫菜胡萝卜素羟化酶基因pucyp97b29编码的蛋白，它的氨基酸序列如序列表seq id no：2所示。
4、本专利技术的胡萝卜素羟化酶基因来源于脐形紫菜(porphyra umbilicalis)，名称为pucyp97b29，以下该基因简称为puchy。
5、所述的胡萝卜素羟化酶基因来源于脐形紫菜。
6、一种重组表达载体，它包括权利要求1所述的基因。
7、一种转化子，它包括含有权利要求4所述的重组表达载体的宿主细胞。
8、所述的一种转化子，它的宿主为微生物、植物或转基因细胞系。
9、本专利技术的一种胡萝卜素羟化酶基因的应用，它用于紫菜类胡萝卜素代谢基因工程中。
10、本专利技术的胡萝卜素羟化酶基因puchy获取方式为：
11、一：总rna的提取
12、选取脐形紫菜(porphyra umbilicalis)(来自江苏省海洋水产研究所国家级紫菜种质库)，采用rnaiso试剂盒(takara公司)提取得到脐形紫菜总rna，经电泳检测和紫外分光光度计检测确认rna的完整性、纯度以及浓度后，于-80℃保存；
13、二、一种脐形紫菜胡萝卜素羟化酶基因(puchy)的克隆及表达载体的构建
14、应用1μg步骤一获得的总rna作为反转录模板，按照primescript 1st strandcdna synthesis kit(takara)的说明书操作，经反转录合成cdna第一链后，应用反转录pcr程序进行pcr扩增，以获得puchy的orf全长(带有pmal-c5x同源臂)。用targetp和chlorop等软件推测puchy蛋白中信号肽的位点，然后扩增puchy截除信号肽后部分序列并克隆至pmal-c5x载体。引物序列如下：
15、f端引物如下
16、gcgatatcgtcgacggatccgctggtgagcgggag
17、r端引物如下
18、cttatttaattacctgcagggaattctgctgagcgagcttg
19、其中，小写字母代表同源臂序列，大写字母是作为引物的基因的序列。
20、将带有pmal-c5x同源臂的基因片段根据clonexpress ii one step cloning kit(vazyme)试剂盒的操作说明进行同源重组，测序后经拼接获得puchy截除信号肽后部分序列。
21、三、酶活鉴定
22、利用大肠杆菌色素系统进行puchy的酶活鉴定。将pmal-puchy和双表达载体pcdf-deut/pulcyb-pylcye与携带有一系列噬夏孢欧文氏菌类胡萝卜素合成相关基因crte(ggps)、crtb(psy)和crti(pds/zds)的载体pac-lyc共转入大肠杆菌。
23、载体pac-lyc上携带的基因在有活性番茄红素β-环化酶和ε-环化酶的情况下，可以使大肠杆菌的细胞主要积累α-胡萝卜素和β-胡萝卜素，pcdf-deut/本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种紫菜胡萝卜素羟化酶基因，其特征在于它的核苷酸序列如序列表Seq ID No：1所示。
2.一种紫菜胡萝卜素羟化酶基因编码的蛋白，其特征在于它的氨基酸序列如序列表Seq ID No：2所示。
3.根据权利要求1、2所述的胡萝卜素羟化酶基因编码的蛋白，其特征在于是一种古老的来源于红藻的双功能酶。
4.一种重组表达载体，其特征在于它包括权利要求1所述的基因。
5.根据权利要求1所述的一种紫菜胡萝卜素羟化酶基因的应用，其特征在于它用于紫菜类胡萝卜素代谢基因工程中。
【技术特征摘要】
1.一种紫菜胡萝卜素羟化酶基因，其特征在于它的核苷酸序列如序列表seq id no：1所示。
2.一种紫菜胡萝卜素羟化酶基因编码的蛋白，其特征在于它的氨基酸序列如序列表seq id no：2所示。
3.根据权利要求1、2所述的胡萝卜素...
【专利技术属性】
技术研发人员：卢山，吕德新，葛子涵，陈语凡，韩东，
申请(专利权)人：南京大学，
类型：发明
国别省市：
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