一种稻瘟病抗性基因Pi2的功能性分子标记及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种稻瘟病抗性基因Pi2的功能性分子标记及其应用。稻瘟病抗性基因Pi2的功能性分子标记，其特征在于，包括以下引物：2Pi2‑F：5’‑GACAGTTTCATTATGACAACTTTAG‑3’；2Pi2‑R：5’‑AAGTGTTCCACCATCTGAGATTCCT‑3’；2WT‑R：5’‑AAGTGTTCCAATATCTGATAATAAC‑3’或2WT‑1R：5’‑AAGTGTTCCAATAATACCTGAGAATAAC‑3’。本发明专利技术简便快速、成本低廉，适用于Pi2改良水稻稻瘟病抗性的分离群体的分子标记辅助选择，提高育种效率，满足大规模分子育种的需求。

Functional molecular marker of rice blast resistance gene Pi2 and its application

The invention discloses a functional molecular marker of rice blast resistance gene Pi2 and its application. Functional molecular marker of rice blast resistance gene Pi2, which is characterized in that includes the following primer: 2Pi2 F:5 'GACAGTTTCATTATGACAACTTTAG 3'; 2Pi2 R:5 AAGTGTTCCACCATCTGAGATTCCT '3' 2WT R:5 '; AAGTGTTCCAATATCTGATAATAAC 3' 1R:5 'or 2WT AAGTGTTCCAATAATACCTGAGAATAAC 3'. The invention is simple, fast and low cost, and is suitable for the molecular marker assisted selection of the separated population of Pi2 for improving rice blast resistance, so as to improve the breeding efficiency and meet the requirement of large-scale molecular breeding.

【技术实现步骤摘要】
一种稻瘟病抗性基因Pi2的功能性分子标记及其应用
：本专利技术属于农作物分子育种领域，具体涉及一种稻瘟病抗性基因Pi2的功能性分子标记及其应用。
技术介绍
：我国是世界上年产稻谷最多的国家，水稻产量的稳定性直接关系到国计民生。由稻瘟病菌引起的稻瘟病是对水稻生产危害最严重的病害之一，被称为水稻的癌症。目前，发掘和利用广谱稻瘟病抗性基因来培育抗病的水稻品种是控制稻瘟病的主要措施。传统的水稻抗病育种依赖于人工接种和植株表型的选择，费时费力，并且受到病菌菌株和病菌发病条件等的影响，选育效率较低。而利用与目的基因紧密连锁的分子标记虽然大大提高了育种效率，但应用过程中也存在受到遗传背景以及遗传重组的限制，最终辅助选择失败。因此，直接对稻瘟病抗性基因进行选择，是最有效的抗性鉴定方法。其中，利用稻瘟病抗病基因序列，建立与抗病基因完全共分离的特异性标签，可达到100％选择的准确性。此外，通过鉴定抗病基因及其等位基因在功能区域的特异性保守序列，进而建立抗病基因及其等位基因在功能区域的特异性标签，有助于鉴定杂交后代的纯杂合基因型，即便扩大选育亲本的范围也同样适用，大大加速了育种的进程。目前在水稻第6染色体短臂端的Pi2/9基因簇内，至少有10个稻瘟病抗性基因(Pi2,Piz,Piz-t,Pi40,Pigm,Pi9,Pi25,Pi26,Pi50,Pi2-2)定位其中。其中Pi2是一个广谱抗性基因，在稻瘟病抗性育种方面具有重要的应用价值(Jiangetal.2012)。Pi2、Pi9以及Piz-t已经被成功克隆，彼此之间在核苷酸水平上的一致性范围为71.8％～98.6％(Quetal.2006,Zhouetal.2006)。目前，跟踪抗稻瘟病基因Pi2的分子标记一般用紧密连锁的SSR标记如AP22，距离Pi2均有一定的距离，选择效率无法达到100％，也无法直接用来检测水稻样品中是否含有Pi2基因。利用Pi2的基因序列与日本晴等位基因的序列差异，建立了Pi2基因的共显性分子标记M-Pi2，此标记虽然可以鉴定Pi2，但是无法区分Pi2和Piz-t，并且无法鉴定出纯杂合基因型(Gaoetal.2010)。基于Pi2基因序列单碱基差异得到的分子标记，通过PCR扩增得到的产物，经PstI或HinfI酶切后，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，可特异地鉴定出Pi2(Huaetal.2015,Tianetal.2016)，但此方法步骤较为繁琐，在进行产业化分子育种过程中，需耗费较多的时间和费用。
技术实现思路
：本专利技术的目的是提供一种能够适用于Pi2改良水稻稻瘟病抗性的分离群体的分子标记辅助选择，提高育种效率，满足大规模分子育种的需求，特异性高，可以快速鉴定后代分离群体的纯杂合基因型的稻瘟病抗性基因Pi2的功能性分子标记。本专利技术的稻瘟病抗性基因Pi2的功能性分子标记，其特征在于，包括以下引物：2Pi2-F：5’-GACAGTTTCATTATGACAACTTTAG-3’，其序列如SEQIDNO.1所示；2Pi2-R：5’-AAGTGTTCCACCATCTGAGATTCCT-3’，其序列如SEQIDNO.2所示；2WT-R：5’-AAGTGTTCCAATATCTGATAATAAC-3’，其序列如SEQIDNO.3所示或2WT-1R：5’-AAGTGTTCCAATAATACCTGAGAATAAC-3’，其序列如SEQIDNO.4所示。即包括2Pi2-F、2Pi2-R和2WT-R；或者2Pi2-F、2Pi2-R和2WT-1R。本专利技术的第二个目的是提供一种检测是否含有稻瘟病抗性基因Pi2以及是纯、杂合基因型的方法，其特征在于，包括以下步骤：提取待测水稻基因组DNA，以该基因组DNA作为模板，分别用上述引物中的2Pi2-F/2Pi2-R和2Pi2-F/2WT-R进行PCR扩增，检测PCR扩增产物，或者，分别用上述引物中的2Pi2-F/2Pi2-R和2Pi2-F/2WT-1R进行PCR扩增，检测PCR扩增产物，对应下表即可判断待测水稻基因组中是否含有稻瘟病抗性基因Pi2以及待测水稻的稻瘟病抗性基因Pi2纯、杂合基因型；也就是说提取待测水稻基因组DNA，以该基因组DNA作为模板，先用2Pi2-F/2Pi2-R进行扩增，如果得到416bp的产物，那么待测水稻含有稻瘟病抗性基因Pi2；然后以该基因组DNA作为模板，分别用2Pi2-F/2WT-R或2Pi2-F/2WT-1R进行PCR扩增，检测PCR扩增产物，如果没有PCR扩增产物，那么该待测水稻就是Pi2纯合型；如果扩增得到416bp(对应引物对2Pi2-F/2WT-R)或419bp(对应引物对2Pi2-F/2WT-1R)的扩增产物，那么该待测水稻就是Pi2杂合型；用2Pi2-F/2Pi2-R进行扩增，如果不能得到416bp的产物，那么待测水稻不含有稻瘟病抗性基因Pi2；然后以该基因组DNA作为模板，分别用2Pi2-F/2WT-R或2Pi2-F/2WT-1R进行PCR扩增，检测PCR扩增产物，扩增得到416bp(对应引物对2Pi2-F/2WT-R)或419bp(对应引物对2Pi2-F/2WT-1R)的扩增产物，该待测水稻就是Pi2的等位基因纯合型。优选，所述的PCR，其反应体系为：DNA模板1.0μL、10μM2Pi2-F0.5μL、10μM2Pi2-R或2WT-R0.5μL、2×TaqPCRMasterMix5μL，其余由双蒸灭菌水补足至10μL，反应条件为：94℃预变性5min；94℃30sec，55℃30sec，72℃30sec，共运行35个循环；72℃延伸5min。本专利技术的第三个目的是提供上述稻瘟病抗性基因Pi2的功能性分子标记在判断待测水稻基因组中是否含有稻瘟病抗性基因Pi2以及待测水稻的稻瘟病抗性基因Pi2纯、杂合基因型中的应用。本专利技术具有如下明显的有益效果：(1)本专利技术简便快速、成本低廉，适用于Pi2改良水稻稻瘟病抗性的分离群体的分子标记辅助选择，提高育种效率，满足大规模分子育种的需求。(2)本专利技术提供的分子标记特异性高：通过比对Pi2及其等位基因在多个品种中功能LRR区域的保守性和特异性，同时结合已报导的Pi2与Pi9、Piz-t以及其余21个品种在该LRR区域的保守性和特异性(Tianetal.2016)，开发的2Pi2-F/2Pi2-R和2Pi2-F/2WT-R(或者2Pi2-F/2WT-1R)引物对可以特异性的扩增Pi2和其等位基因。(3)本专利技术提供的分子标记可以快速鉴定后代分离群体的纯杂合基因型，对于加速育种进程有着重要的作用。(4)本专利技术是在Pi2基因内部的功能LRR区域序列，并且是测定了多个品种后开发的分子标记，因此，即便扩大亲本选育范围，此方法仍然适用。附图说明图1为本专利技术实施例1中对多个水稻品种的Pi2及其等位基因在LRR区域的序列对比图；其中，左边为对应的水稻品种名称，右边为测序序列；虚线框内(下横线所对应部分)表示Pi2基因与所测序品种在LRR区域特异性的保守序列。图2为本专利技术实施例1中BL122-Pi2杂合体在该区域序列的测序峰图；其中，箭头表示在该位点核苷酸的测序结果为双峰。图3为本专利技术实施例1中例举的已经公开发表的Pi2与Pi9、Piz-t以及其余21个品种在Pi2的LR本文档来自技高网...

【技术保护点】
稻瘟病抗性基因Pi2的功能性分子标记，其特征在于，包括以下引物：2Pi2‑F：5’‑GACAGTTTCATTATGACAACTTTAG‑3’；2Pi2‑R：5’‑AAGTGTTCCACCATCTGAGATTCCT‑3’；2WT‑R：5’‑AAGTGTTCCAATATCTGATAATAAC‑3’或2WT‑1R：5’‑AAGTGTTCCAATAATACCTGAGAATAAC‑3’。

【技术特征摘要】
1.稻瘟病抗性基因Pi2的功能性分子标记，其特征在于，包括以下引物：2Pi2-F：5’-GACAGTTTCATTATGACAACTTTAG-3’；2Pi2-R：5’-AAGTGTTCCACCATCTGAGATTCCT-3’；2WT-R：5’-AAGTGTTCCAATATCTGATAATAAC-3’或2WT-1R：5’-AAGTGTTCCAATAATACCTGAGAATAAC-3’。2.一种检测是否含有稻瘟病抗性基因Pi2以及是纯、杂合基因型的方法，其特征在于，包括以下步骤：提取待测水稻基因组DNA，以该基因组DNA作为模板，分别用权利要求1中的引物中的2Pi2-F/2Pi2-R和2Pi2-F/2WT-R进行PCR扩增，检测PCR扩增产物，或者，分别用权利要求1中的引物中的2Pi2-F/2Pi2-R和2Pi2-F/2WT-1...

【专利技术属性】
技术研发人员：张明永，杨武，范甜，夏快飞，曾璇，胡锐，邱迪洋，李茂霖，成太辉，陈建通，
申请(专利权)人：中国科学院华南植物园，
类型：发明
国别省市：广东,44