本发明专利技术属于水产动物种质创新技术领域，具体涉及一种基于多标记组合辅助凡纳滨对虾抗WSSV选育的方法及其应用。利用高通量分型技术对凡纳滨对虾免疫信号通路的SNP位点在敏感群体和抗性群体中进行SNP标记分型，获得了6个与抗WSSV显著相关的SNP分子标记。利用多标记互作分析方法，筛选获得了一种最优的抗性标记组合，该标记组合包括nLvALF2g‑89‑A>G,Unigene34569g‑97‑T>C和TRAF6g‑139‑A>G，三个标记的AA‑TT‑AA,AA‑CT‑AA,AA‑CT‑AG,AG‑CT‑AA的四种基因型组合表现出与WSSV抗性明显的关联优势。本发明专利技术为对虾抗病分子选育提供了候选的标记，为对虾分子标记辅助抗性育种提供了一种新的途径，在对虾抗WSSV品种选育的研究中具有广阔的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于水产动物种质创新
，具体涉及凡纳滨对虾抗性相关的多组合分子标记。
技术介绍
凡纳滨对虾是世界养殖规模和产量最大的对虾品种，自1988年引进中国以来，凡纳滨对虾的产量急剧增长，目前已经成为我国最重要的水产养殖品种。然而，随着养殖规模的扩大，病害的暴发也越来越频繁，其中WSSV因致死率高、传播快使得其成为影响世界对虾产业最严重的疾病。培育抗病新品种是解决对虾病害问题的一种重要手段。相较于传统选育手段，结合分子标记辅助选育的现代育种技术在抗病选育中具有较多的优势，表现为选育准确性高、不易受环境干扰等特点，因此挖掘抗性相关分子标记，运用分子标记辅助选育成为遗传育种工作者研究的热点(Liu Z.J.,Cordes J.F.DNA marker technologies and their applications in aquaculture genetics.Aquaculture,2004，238(1-4):1-37)。随着对白斑综合症入侵和感染过程的深入研究，研究人员发掘了多个与WSSV抗性相关的重要免疫因子和效应因子(Xiang J.,Li F.Recent advances in researches on the innate immunity of penaeid shrimp.Fish&Shellfish Immunology 2013,34(6):1685-1685)，这些基因参与对虾机体抵抗WSSV入侵的过程，对于对虾免疫稳态的维持具有重要作用，通过分析这些基因的遗传多样性及其与WSSV抗性之间的关系，有助筛选出抗WSSV相关的分子标记，为辅助抗WSSV品种的选育提供指导。在前期的研究中，研究人员发现了多个与抗WSSV性状显著先关的分子标记(Liu J.,Yu Y.,Li F.,Zhang X.,Xiang J.A new anti-lipopolysaccharide factor(ALF)gene with its SNP polymorphisms related to WSSV-resistance of Litopenaeus vannamei.Fish&Shellfish Immunology 2014,39(1):24-33；Liu J.,Yu Y.,Li F.,Zhang X.,Xiang J.A new ALF from Litopenaeus vannamei and its SNPs related to WSSV resistance.Chinese Journal of Oceanology and Limnology.2014,32(6):1232-1247)，这些标记在抗性材料和易感材料中具有显著性差异，利用这些分子标记建立了辅助抗性选育的技术手段。但是之前的报道多为单个标记在抗性育种中的应用，多个标记组合辅助选育尚未报道。因为对虾的抗性性状是由多个位点控制的，多个位点的组合选育效果应该优于单一位点的选择。
技术实现思路
本专利技术旨在提供一种一种凡纳滨对虾抗性相关的多组合分子标记和应用。为实现上述目的，本专利技术采用技术方案为：一种凡纳滨对虾抗性相关的多组合分子标记，组合标记位点为位于SEQIDALF2序列的89bp(ALF2g-89-A>G)，SEQIDUnigene34569g序列的97bp(Unigene34569g-97-T>C)，SEQIDTRAF6g序列的139bp(TRAF6g-139-A>G)。所述三个标记的基因型组合分别为AA-TT-AA,AA-CT-AA,AA-CT-AG,AG-CT-AA。所述多组合分子标记是利用高通量分型技术对凡纳滨对虾免疫信号通路的77个SNP位点在敏感群体和抗性群体中进行标记分型后，利用关联分析方法获得了6个与抗WSSV显著相关的分子标记(P<0.05)。进一步采用多标记互作分析方法，获得了一种最优的抗性标记组合，该标记组合包括ALF2g-89-A>G，Unigene34569g-97-T>C,TRAF6g-139-A>G三个标记。一种用于检测权凡纳滨对虾抗性相关的标记组合的Multiplex SnaPshot分型引物对：ALF2g-89-A>G位点的扩增引物对为：ALF2F：5’-AACCCTTTCGCTCCCACC-3’，ALF2R：5’-TGGATGAGGTATCAACATTCGC-3’；Unigene34569g-97-T>C位点的扩增引物对为：Unigene34569F：5’-ACTTGGGCAACGTCATCG-3’，Unigene34569R：5’-GAGTTCCAGTCCAGGGAAATG-3’；TRAF6g-139-A>G位点的扩增引物对为：TRAF6F：5’-TATCACATGGAAATCTGAACAGTA-3’，TRAF6R：5’-GGATTACGAGCAACATCAGGA-3’；以及，ALF2g-89-A>G位点的延伸引物：ALF2G:5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTCGGTGATGAGACCCGCGC-3’Unigene34569g-97-T>C位点的延伸引物：Unigene345695G:’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGTGGCTCGCATCTCCTTATT-3’；TRAF6g-139-A>G位点的延伸引物：TRAF6G:5’-TCTGTGATATGGTTTTTAGGTAATGATA-3’；一种凡纳滨对虾抗性相关的多组合分子标记的应用，所述凡纳滨对虾抗性相关的多组合分子标记在分子标记辅助育种中的应用。一种基于多标记组合辅助凡纳滨对虾抗WSSV选育的方法，1)提取待分析材料的基因组的DNA；2)以待检测分析材料的基因组的DNA为模板，以及权利要求3所述的引物对进行多重扩增，扩增产物再利用权利要求3所述的每个位点的延伸引物使用Multiplex SnaPshot方法对相应的SNP位点进行分型，获得分型信息；3)将上述获得的分型信息中选择AA-TT-AA,AA-CT-AA,AA-CT-AG,AG-CT-AA的基因型个体进行留种和建立家系育种。本专利技术具有的优点包括：本专利技术提供凡纳滨对虾抗WSSV的多个组合的标记，基于本专利技术提供的标记可进行辅助遗传选育，选育方法具有快速、准确、不易受环境影响的特点；同时多个标记的组合选育效果优于单个标记的选育，能够显著提高选育的效率和准确率。附图说明图1为本专利技术实施例提的三个SNP位点Multiplex SNaPshot分型结果图。具体实施方式下面结合附图和实例对本专利技术作进一步说明，但本专利技术并不限于以下的实施例内容。实施例1：凡纳滨对虾WSSV抗性标记组合的获得1.WSSV易感和抗性材料的获得WSSV易感和抗性材料来源于“科海一号”多家系的混合群体。选取500尾健康凡纳滨对虾置于12个50L的水族箱中，实验前随机取10尾对虾检测无WSSV感染，实验水温为(23±1)℃。经饥饿处理后，投喂WSSV感染致死的病虾(WSSV病毒含量为104-106copy/ng DNA)。攻毒后每天检查3次(每次间隔6h)并收集死虾本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种凡纳滨对虾抗性相关的多组合分子标记，其特征在于，组合标记位点分别位于SEQIDALF2序列的89bp(ALF2g‑89‑A>G)，SEQIDUnigene34569g序列的97bp(Unigene34569g‑97‑T>C)和SEQIDTRAF6g序列的139bp(TRAF6g‑139‑A>G)。
【技术特征摘要】
1.一种凡纳滨对虾抗性相关的多组合分子标记，其特征在于，组合标记位点分别位于SEQIDALF2序列的89bp(ALF2g-89-A>G)，SEQIDUnigene34569g序列的97bp(Unigene34569g-97-T>C)和SEQIDTRAF6g序列的139bp(TRAF6g-139-A>G)。2.按权利要求1所述的凡纳滨对虾抗性相关的多组合分子标记，其特征在于：所述三个标记的基因型组合分别为AA-TT-AA,AA-CT-AA,AA-CT-AG,AG-CT-AA。3.一种用于检测权利要求1所述的对凡纳滨对虾抗性相关的标记组合进行分型的Multiplex SnaPshot引物组合，其特征在于：ALF2g-89-A>G位点的扩增引物对为：ALF2F：5’-AACCCTTTCGCTCCCACC-3’，ALF2R：5’-TGGATGAGGTATCAACATTCGC-3’；Unigene34569g-97-T>C位点的扩增引物对为：Unigene34569F：5’-ACTTGGGCAACGTCATCG-3’，Unigene34569R：5’-GAGTTCCAGTCCAGGGAAATG-3’；TRAF6g-139-A>G位点的扩增引物对为：TRAF6F：5’-TATCACATGGAAATCTGAACAGTA-3...
【专利技术属性】
技术研发人员：李富花，于洋，刘敬文，张晓军，相建海，
申请(专利权)人：中国科学院海洋研究所，
类型：发明
国别省市：山东;37
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