本发明专利技术提供了一种基于两核苷酸合成测序的PCR产物SNP分型/突变检测方法。通过循环将两核苷酸同时加入到测序反应中，每个测序反应得到的不是具体的碱基序列，而是加入的两核苷酸种类的编码及其核苷酸合成的编码数目组成的信息，根据每个分析位点的野生型、突变型、杂合型均对应唯一、独特的两类编码及其编码数目的测序信息判断出待测PCR产物的SNP分型/突变类型。利用该测序方法阅读长度的特点，可以实现只需一条测序引物即可获得多个位点的分析，避免了利用多重测序引物进行多个分析。该方法有效减少了SNP分型/突变检测的成本、降低测序所需模板量、提高检测灵敏度、缩短操作时间。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，是一种PCR产物的SNP分型/突变检测方法，具体涉及一种两核苷酸实时合成检测PCR产物的SNP分型/突变，尤其是同一PCR产物中多个SNP分型/突变的方法。
技术介绍
近年来，人类基因组中突变的检测引起了广泛的关注。单核苷酸多态性(SNPs，single nucleotide polymorphisms)和点突变在进化研究和在普通疾病的诊断中得到广泛的应用，使得它逐渐成为分子生物学检测中倍受欢迎的分子标记(markers)。不断出现的新方法和技术为SNP/突变的检测提供了可靠的前景。这些技术大部分基于等位基因特异性杂交技术来鉴定SNP/突变位点，比如，高密度基因芯片、padlock探针、或者PCR扩增。尽管各种操作简单的技术相继出现，为SNPs的检测提供了可行、简便的技术，但是DNA测序技术仍然是检测SNP/突变最可靠的技术。作为SNP/突变检测金标准的Sanger DNA测序技术不仅能鉴定突变而且还能提供碱基的具体信息，但是这一技术需要电泳，且需要对DNA样品进行标记，导致测序耗时耗力。另外一种测序技术——焦磷酸测序，它是一种基于酶联级反应的测序技术。该技术通过每次向反应体系中加入一种脱氧核苷三磷酸(dNTP)，在四种酶的作用下，释放出与核苷酸数量成正比的峰。由于不同类型的SNP/突变特定的峰型，所以通过特定峰的类型可以区分不同的SNP/突变。尽管焦磷酸测序技术被广泛用在临床诊断，科学研究中。但是它仍然拥有几下几个缺点。(1)不同步延伸造成的测序长度较短；(2)有限的测序检测灵敏度。这些问题导致它只能用来检测长度不超过60bp内的几个SNPs。传统的SNPs测序中(每个焦测序反应只检测一个SNP的方法)，每个SNP需要一条测序引物和一对PCR扩增引物，同一条DNA模板上待测的突变数量增加势必导致测序成本大幅。为了降低检测成本，提出了能同时检测同一条DNA模板上几个不同SNPs的多重测序。但是，这种多重焦测序的方法只能同时检测同一条DNA模板上相隔不超过25bp的两个SNPs，并且每个测序反应只能检测不超过3个SNPs。所以，有必要提出一种能利用单次测序反应检测同一条DNA模板上多个不同SNPs的方法。另外，传统焦测序技术中，四个核苷酸(A、G、C、T)轮流加入到聚合反应中。每次加入一个核苷酸，产生一个与加入核苷酸数量成比例 的峰信号。尽管这种技术基于灵敏的酶联级反应，但是它仍然需要pmol级的DNA模板量。对于一些模板量较少或者较珍贵的DNA样本，有必要提出一种能基于微量样本的SNPs测序方法。最近，我们实验室提出一种基于两核苷酸实时合成测序的方法，该方法通过每次反应同时加入未标记的两种dNPTs实时测序，得到两组编码，解码这两组编码便能确定测序片段的具体碱基信息(肖鹏峰等，中国专利技术专利：ZL 2012 1 0128597.6)。该方法具有大幅提高测序长度，且测序得到的峰谱信号比传单核苷酸合成测序的峰谱信号强等特点。诚然，两核苷酸合成焦测序不能测定具体的碱基信息，只能获得由两类编码及其编码数目构成的信息。然而，对比传统的单核苷酸加入的焦测序，对于未知的多模板DNA序列，它原理上同样不能给出Sanger测序方法清晰的“杂合”图谱，只能给出依据核苷酸加入方式得到的具有先后次序的“杂合型”碱基序列，即传统焦测序也不是真正意义上的测序(对碱基序列的识别)，而是对序列“峰型”的识别。基于同样的原理，对于待测序列大致已知、且只有几种可能的序列，如果每种类型PCR产物的一次循环两核苷酸合成焦测序得到由两类编码及其编码数目构成的信息具有唯一性，那么基于“模式”的判断就同样具有唯一性，也就可以用于PCR产物的SNP分型和突变检测。本专利技术利用两核苷酸实时合成测序得到的一组编码信息的特点，使得PCR产物中不同DNA模板序列得到不同的峰谱图。也就是说，PCR产物中分析位点的不同类型在一次两核苷酸合成测序的信息中具有唯一性，从而实现对不同DNA模板类型的区分。本专利技术的目的是提供一种一次两核苷酸合成测序对PCR产物中SNP分型/突变得检测方法。通过两核苷酸同时加入到测序反应中，得到一系列峰谱信息图。在峰谱图中，同一个分析位点的不同类型得到的测序峰型和(或者)峰信号强度不同，根据信号峰型和(或者)峰信号强度不同来判定所分析位点的类型。该方法能有效提高SNP/突变检测的灵敏度、缩短操作时间、节省测序费用。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是，提供一种基于两核苷酸合成测序的PCR产物SNP分型/突变检测方法，尤其是PCR产物中多个SNP/突变位点的方法。为解决上述技术问题，本专利技术采用如下技术方案：一种基于两核苷酸合成测序的PCR产物SNP分型/突变检测方法，包括如下步骤：(1)提取样本的基因组DNA；(2)PCR扩增获得目的片段；(3)利用两核苷酸对目的片段进行两核苷酸同时合成测序反应，所述的两核苷酸为dATPαS、dCTP、dTTP、dGTP中选择的两种不同的核苷酸；(4)由测序图谱得到的SNP位点处的峰型确定SNP分型/突变类型。步骤(3)中，对SNPs位点进行测序时，加入的两核苷酸中只能含有一个可能的突变碱基的互补碱基；对非SNPs位点的碱基进行测序时，从(dATPαS+dGTP)/(dCTP+dTTP)(简写成AG/CT)、(dATPαS+dCTP)/(dGTP+dTTP)(简写成AC/GT)、(dATPαS+dTTP)/(dCTP+dGTP)(简写成AT/CG)中任意选择一种循环加入或几种交替加入。为了保证在分析位点后的DNA模板序列能同步延伸，分析位点处用两个测序反应分析，首先加入的两核苷酸中包含一个(且只能是一个)可能的突变碱基的互补碱基类型，其次再加入含有另一个可能突变碱基的互补碱基类型的两核苷酸。例如，G/T的突变位点中，首先加入含有其中一个互补碱基(如T的互补碱基A)的AT或者AG中的一种，然后再加入含有另一个互补碱基(如G的互补碱基C)的CT、CG中的一种两核苷酸组合。非分析位点的DNA模板序列可以循环加入AG/CT，AC/GT，或者AT/CG中的一种，也可以三种方式交替使用。步骤(2)中，PCR扩增获得目的片段的长度小于500bp。步骤(2)中，PCR所用正向引物的5’端用生物素标记。步骤(3)的具体操作方法如下：(3-1)制备单链DNA模板：将PCR扩增产物与链霉亲和素包裹的磁珠反应，生物素修饰的DNA链固定到所述磁珠上，得到单链DNA模板；(3-2)测序引物杂交：将测序引物与单链DNA模板结合；(3-3)利用两核苷酸对目的片段进行两核苷酸同时合成测序反应。步骤(4)中，判断SNP分型/突变类型的方法是根据峰的类型(两核苷酸的种类)、峰的高度以及峰的排列形式构成测序图谱确定。进一步，dNTPs合成实时释放与插入到DNA模板中核苷酸量相同的检测分子，其检测分子是化学发光检测的焦磷酸盐，电化学检测的氢离子或者光学检测的荧光信号。加入两核苷酸实施测序反应后，测序反应得到的峰的类型(两核苷酸的种类)、峰的高度，以及峰的排列形式构成测序图谱。两核苷酸测序反应鉴定依据为同一个分析位点不同类型(如SNP中“纯合子”、“杂合子”，点本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种基于两核苷酸合成测序的PCR产物SNP分型/突变检测方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)提取样本的基因组DNA；(2)PCR扩增获得目的片段；(3)利用两核苷酸对目的片段进行两核苷酸同时合成测序反应，所述的两核苷酸为dATPαS、dCTP、dTTP、dGTP中选择的两种不同的核苷酸，每个测序反应得到的测序信息包括加入的两核苷酸的种类信息、以及核苷酸合成的数目信息；(4)由测序图谱得到的SNP位点处的峰型确定SNP分型/突变类型。
【技术特征摘要】
1.一种基于两核苷酸合成测序的PCR产物SNP分型/突变检测方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)提取样本的基因组DNA；(2)PCR扩增获得目的片段；(3)利用两核苷酸对目的片段进行两核苷酸同时合成测序反应，所述的两核苷酸为dATPαS、dCTP、dTTP、dGTP中选择的两种不同的核苷酸，每个测序反应得到的测序信息包括加入的两核苷酸的种类信息、以及核苷酸合成的数目信息；(4)由测序图谱得到的SNP位点处的峰型确定SNP分型/突变类型。2.根据权利要求1所述的基于两核苷酸合成测序的PCR产物SNP分型/突变检测方法，其特征在于，步骤(3)中，两核苷酸同时合成测序反应从(dATPαS+dGTP)/(dCTP+dTTP)、(dATPαS+dCTP)/(dGTP+dTTP)、(dATPαS+dTTP)/(dCTP+dGTP)中任意选择一种循环加入或几种交替加入。3.根据权利要求1所述的基于两核苷酸合成测序的PCR产物SNP分型/突变检测方法，其特征在于，步骤(2)中，PCR扩增获得目的片段的长度小于500bp。4.根据权利要...
【专利技术属性】
技术研发人员：肖鹏峰，王柳，
申请(专利权)人：东南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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