本发明专利技术提公开一种SSR分子标记技术在油用牡丹上的标记方法。本方法包括设计引物、牡丹基因组DNA的提取、扩增反应、聚丙烯酰胺凝胶电泳检测等步骤。本方法通过PCR反应扩增微卫星片段，将扩增产物进行凝胶电泳检测，条带丰富，不使用同位素实验过程简单、实用、耗时短成本低的效果，并且具有标记数量多，随机分布于动植物整个基因组；每个标记等位位点有较高多态性，多态信息含量高；标记呈孟德尔方式遗传，共显性标记；实验操作过程对DNA质量要求不高，DNA用量少，可靠性好，重复性好；适合油用牡丹属SSR分子标记的扩增，还改进了聚丙烯酰胺凝胶电泳中银染的方法，既节省时间，又节约成本，进一步提高了SSR分子标记在牡丹属上应用的效率。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子生物学领域，具体的说是一种SSR分子标记技术在油用牡丹上的标记方法。
技术介绍
牡丹(Paeonia suffruticosa Andr.)为芍药科芍药属牡丹组的木本植物，是原产于中国的传统名花。其品种丰富，花朵硕大，多姿多彩，雍容华贵。素有“国色天香”、“花中之王”之称。每年4～5月开花，朵大色艳，奇丽无比，姿丰典雅，花香袭人，深受人们的喜爱。因此，提高牡丹的研究水平，为促进牡丹产业化发展具有重要意义。分子标记是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标记，是DNA水平遗传多态性的直接反映。与其他几种遗传标记，例如：形态学标记、生物化学标记、细胞学标记相比，DNA分子标记具有的优越性，体现在大多数分子标记为共显性，对隐性的性状的选择十分便利；基因组变异极其丰富，分子标记的数量几乎是无限的；在生物发育的不同阶段，不同组织的DNA都能够用于标记分析；分子标记揭示来自DNA的变异；表现为中性，不影响目标性状的表达，与不良性状无连锁；检测手段简单、迅速。随着分子生物学技术的发展，现在DNA分子标记技术已有数十种，广泛应用于遗传育种、基因组作图、基因定位、物种亲缘关系鉴别、基因库构建、基因克隆等方面。SSR(Simple Sequence Repeats)标记是近年来发展起来的一种以特异引物PCR为基础的分子标记技术，也称为微卫星DNA(MicrosatelliteDNA),是一类由几个核苷酸(一般为1～6个)为重复单位组成的长达几十个核苷酸的串联重复序列。SSR标记的基本原理为：根据微卫星序列两端互补序列设计引物，通过PCR反应扩增微卫星片段，由于核心序列串联重复数目不同，因而能够用PCR的方法扩增出不同长度的PCR产物，将扩增产物进行凝胶电泳，根据分离片段的大小决定基因型并计算等位基因频率。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种SSR分子标记技术在油用牡丹上的标记方法，通过PCR反应扩增微卫星片段，将扩增产物进行凝胶电泳，根据分离片段的大小决定基因型并计算等位基因频率，达到实验过程简单、实用、耗时短成本低的效果。本专利技术所述一种SSR分子标记技术在油用牡丹上的标记方法，其特征在于：包括以下步骤：步骤一、设计引物利用前人已开发的SSR引物序列，在油用牡丹中进行多态性筛选，选择多态性好的引物或引物组合作为鉴定油用牡丹的分子身份证；步骤二、牡丹基因组DNA的提取1)向离心管中预先加入1ml CTAB抽提液及20μl的β-巯基乙醇，混匀，65℃预热；2)称取0.20g油用牡丹幼叶用液氮磨成粉末，转入步骤A)离心管中，摇匀，于65℃水浴45min；3)冷却至室温后加入等体积氯仿或异戊醇，混匀使乳化10min，10000rpm室温离心10min；4)吸取上清液加入与上清液等体积的异丙醇混匀，得到白色絮状沉淀；5)将白色絮状沉淀进行漂洗；6)漂洗后白色絮状沉淀于37℃以下的恒温箱中干燥至半透明；7)用500μl 1xTE溶解沉淀，溶解后-20℃保存；三、扩增反应1)将引物稀释到10μmol/l后备用；2)在PCR离心管内配制20μl PCR反应液；3)PCR反应程序：将配制好的PCR反应液，置于PCR仪内，进行PCR反应，反应程序为：94℃预变性3min，94℃变性30s，退火30s,72℃延伸1min，30个循环；四、聚丙烯酰胺凝胶电泳检测1)在8％聚丙烯酰胺凝胶，倒入1×TBE电泳缓冲液，没过短板约2～3mm；2)吸取2～3μl样品加入到样品孔中，在待测样品左侧的样品孔里加入2μl适合的DNA分子量标记以作参考；3)接上电源连接线，打开电泳仪开关，选用稳压模式，电压选择100v，开始电泳；4)取下凝胶，超纯水中浸泡2分钟，倒掉超纯水，加入400ml 0.05％硝酸银溶液，置于摇床上50rpm，染色10～15分钟，冲洗；5)加入新配制好的显色液，50rpm轻摇5～10分钟，直至条带清晰可见，倒出显色液，用超纯水冲洗凝胶后捞出，扫描图像，储存文件；五、数据处理使用凝胶成像系统分析软件，对所扫描的图片进行分析，可根据标准分子量的大小，计算目的条带的分子量大小，并记录；六、分析结果。所述CTAB溶液由Tris-Hcl、EDTA、Nacl和水组成，其中10ml CTAB溶液按体积比取1ml 1mol/l Tris-Hcl，0.4ml 0.5mol/l EDTA，3ml 5mol/l Nacl，余量为水。所述PCR反应液由Power Taq PCR Mastermix、Forward Primer、Reverse Primer、DNA和水组成，其中20μlPCR反应液由2×Power Taq PCR Mastermix10μl，Forward Primer 1μl，Reverse Primer 1μl，DNA 2μl，余量为水。所述TE溶液由Tris-Hcl、EDTA和水组成，其中500μlTE溶液按体积比取5μl 1mol/l的Tris-Hcl，1ml 0.5mol/l的EDTA，余量为水。所述TBE溶液由Tris、硼酸、EDTA和水组成，其中1LTBE溶液按体积比取Tris 108g，硼酸55g，0.5M/L的EDTA 40ml，余量为水。所述聚丙烯酰胺凝胶由TBE、丙烯酰胺、过硫酸铵、TEMED和水组成，其中21ml灭菌水、3ml 10×TBE、6ml 40％丙烯酰胺、240μl 10％过硫酸铵、30μl TEMED。所述显影液由NaOH、四硼酸钠和水组成，其中1L显影液按体积比取15g NaOH、0.2g四硼酸钠，余量为水。所述显影液的显色方法为，甲醛在显色时加，显色液400ml加入甲醛1.6ml。10×TBE电泳缓冲液配方Tris碱(g)108216270硼酸(g)55110137.50.5M/L EDTA(ml)ph＝8.04080100水定容至1L2L2.5L显色液配方(L)氢氧化钠(g)153037.5四硼酸钠(g)0.20.40.5水定容至1L2L2.5L本专利技术所述一种SSR分子标记技术在油用牡丹上的标记方法，其有益效果在于：通过PCR反应扩增微卫星片段，将扩增产物进行凝胶电泳检测，条带丰富，不使用同位素实验过程简单、实用、耗时短成本低的效果，并且具有标记数量多，随机分布于动植物整个基因组；每个标记等位位点有较高多态性，多态信息含量高；标记呈孟德尔方式遗传，共显性标记；实验操作过程对DNA质量要求不高，DNA用量少，可靠性好，重复性好；对油用牡丹SSR分子标记意义重大，在本专利技术中选择性扩增PCR体系得到优化，更适合油用牡丹属SSR分子标记的扩增，而且还改进了聚丙烯酰胺凝胶电泳中银染的方法，将银染中固定和染色步骤合二为一，既节省时间，又节约成本，进一步提高了SSR分子标记在牡丹属上应用的效率。附图说明图1为选择性扩增聚丙烯酰胺凝胶电泳检测图；图2为选择性扩增聚丙烯酰胺凝胶电泳检测图；图3为选择性扩增聚丙烯酰胺凝胶电泳检测图；图4为选择性扩增聚丙烯酰胺凝胶电泳检测图；图5为选择性扩增聚丙烯酰胺凝胶电泳检测图；图6为选择性扩增聚丙烯酰胺凝胶电泳检测图；图7为选择性扩增聚丙烯酰胺凝胶电泳检测图。具体实施方式实验材料：甘肃紫斑牡丹、六安凤丹、金川凤丹、铜陵凤丹、亳州凤丹、菏泽本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种SSR分子标记技术在油用牡丹上的标记方法，其特征在于：包括以下步骤：步骤一、引物序列引物1：F：5’‑AACTGCTGAGGGCATAGAG‑3’R：5’‑CATGATGTTGAGCCACCC‑3’；引物2：F：5’‑ACCTCCTAGACCCAGAGC‑3’R：5’‑GCAACAATCCTGGTAGTGA‑3’；引物3：F：5’‑CAATCCGAGTCGTAAGC‑3’R：5’‑CACCTCCTAGACCCAGAG‑3’；引物4：F：5’‑GGGGACTCAAATCCTTGCGAAAACCA‑3’R：5’‑AGGCCTAGTTTTGGTCTGGGCG‑3’；引物5：F：5’‑AGGAGATTGACCGATTGATA‑3’R：5’‑CTGTCTGGCATGGAACG‑3’；引物6：F：5’‑GACCGATTTGACCCTCTA‑3’R：5’‑CTCCCATGTGATGTTGTG‑3’；引物7：F：5’‑TCCTAGACCCAGAGCACC‑3’R：5’‑GATGTCCCTGAGCCAAGT‑3’；步骤二、牡丹基因组DNA的提取1)向离心管中预先加入1ml CTAB抽提液及20μl的β‑巯基乙醇，混匀，65℃预热；2)称取0.20g幼叶用液氮磨成粉末，转入步骤A)离心管中，摇匀，于65℃水浴45min；3)冷却至室温后加入等体积氯仿或异戊醇，混匀使乳化10min，10000rpm室温离心10min；4)吸取上清液加入与上清液等体积的异丙醇混匀，得到白色絮状沉淀；5)将白色絮状沉淀进行漂洗；6)漂洗后白色絮状沉淀于37℃以下的恒温箱中干燥至半透明；7)用500μl 1xTE溶解沉淀，溶解后‑20℃保存；三、扩增反应1)将引物稀释到10μmol/l后备用；2)在PCR离心管内配制20μl PCR反应液；3)PCR反应程序：将配制好的PCR反应液，置于PCR仪内，进行PCR反应，反应程序为：94℃预变性3min，94℃变性30s，退火30s,72℃延伸1min，30个循环；四、聚丙烯酰胺凝胶电泳检测1)在8％聚丙烯酰胺凝胶，倒入1×TBE电泳缓冲液，没过短板约2～3mm；2)吸取2～3μl样品加入到样品孔中，在待测样品左侧的样品孔里加入2μl适合的DNA分子量标记以作参考；3)接上电源连接线，打开电泳仪开关，选用稳压模式，电压选择100v，开始电泳；4)取下凝胶，超纯水中浸泡2分钟，倒掉超纯水，加入400ml 0.05％硝酸银溶液，置于摇床上50rpm，染色10～15分钟，冲洗；5)加入新配制好的显色液，50rpm轻摇5～10分钟，直至条带清晰可见，倒出显色液，用超纯水冲洗凝胶后捞出，扫描图像，储存文件；五、数据处理使用凝胶成像系统分析软件，对所扫描的图片进行分析，可根据标准分子量的大小，计算目的条带的分子量大小，并记录；六、分析结果。...
【技术特征摘要】
1.一种SSR分子标记技术在油用牡丹上的标记方法，其特征在于：包括以下步骤：步骤一、引物序列引物1：F：5’-AACTGCTGAGGGCATAGAG-3’R：5’-CATGATGTTGAGCCACCC-3’；引物2：F：5’-ACCTCCTAGACCCAGAGC-3’R：5’-GCAACAATCCTGGTAGTGA-3’；引物3：F：5’-CAATCCGAGTCGTAAGC-3’R：5’-CACCTCCTAGACCCAGAG-3’；引物4：F：5’-GGGGACTCAAATCCTTGCGAAAACCA-3’R：5’-AGGCCTAGTTTTGGTCTGGGCG-3’；引物5：F：5’-AGGAGATTGACCGATTGATA-3’R：5’-CTGTCTGGCATGGAACG-3’；引物6：F：5’-GACCGATTTGACCCTCTA-3’R：5’-CTCCCATGTGATGTTGTG-3’；引物7：F：5’-TCCTAGACCCAGAGCACC-3’R：5’-GATGTCCCTGAGCCAAGT-3’；步骤二、牡丹基因组DNA的提取1)向离心管中预先加入1ml CTAB抽提液及20μl的β-巯基乙醇，混匀，65℃预热；2)称取0.20g幼叶用液氮磨成粉末，转入步骤A)离心管中，摇匀，于65℃水浴45min；3)冷却至室温后加入等体积氯仿或异戊醇，混匀使乳化10min，10000rpm室温离心10min；4)吸取上清液加入与上清液等体积的异丙醇混匀，得到白色絮状沉淀；5)将白色絮状沉淀进行漂洗；6)漂洗后白色絮状沉淀于37℃以下的恒温箱中干燥至半透明；7)用500μl 1xTE溶解沉淀，溶解后-20℃保存；三、扩增反应1)将引物稀释到10μmol/l后备用；2)在PCR离心管内配制20μl PCR反应液；3)PCR反应程序：将配制好的PCR反应液，置于PCR仪内，进行PCR反应，反应程序为：94℃预变性3min，94℃变性30s，退火30s,72℃延伸1min，30个循环；四、聚丙烯酰胺凝胶电泳检测1)在8％聚丙烯酰胺凝胶，倒入1×TBE电泳缓冲液，没过短板约2～3mm；2)吸取2～3μl样品加入到样品孔中，在待测样品左侧的样品孔里加入2μl适合的DNA分子量标记以作参考；3)接上电源连接线，打开电泳仪开关，选用稳压模式，电压选择100v，开始电泳；4)取下凝胶，超纯水中浸泡2分钟，倒掉超纯水，加入400ml 0.05％硝酸银溶液，置于摇床上50rpm，...
【专利技术属性】
技术研发人员：张涛，黄兴琳，陆俊杏，廖冰楠，白瑞英，
申请(专利权)人：重庆师范大学，
类型：发明
国别省市：重庆;50
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