本发明专利技术提供了一种利用TaqMan探针检测番石榴实蝇的方法，包括以下步骤：（1）设计引物和探针：上游引物序列见SEQ ID No：1，下游引物序列见SEQ ID No：2，探针序列见SEQ ID No：3；（2）采用步骤（1）设计的引物和探针进行荧光定量PCR检测。通过设计特异性引物和TaqMan探针，建立检测番石榴实蝇的方法，可快速、准确地检测出番石榴实蝇。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，具体涉及一种利用TaqMan探针检测番石榴实蝇的方法及检测用引物和探针。
技术介绍
番石榴实蝇Bactrocera correcta，隶属于双翅目(Diptera)、实蝇科(Tephritidae)、寡鬃实蝇亚科(Dacinae)、寡鬃实蝇族(Dacini)，番石榴实蝇是危害番石榴、芒果、柑橘类和辣椒等多种热带与亚热带水果和蔬菜的重要害虫，主要发生在印度、泰国、巴基斯坦、尼泊尔、斯里兰卡、中国(台湾、云南)等地，是多种热带、亚热带水果和蔬菜的重要害虫，1992年被列入《中华人民共和国进境植物检疫危险性病、虫、杂草名录》。我国每年从东南亚疫区贸易性进口水果或进境旅客携带的水果中多次检出该种害虫，口岸检疫截获频率较高。为保护中国的农业生产和生态安全，防止番石榴实蝇的传播，必须制定严格的检验检疫制度和防除措施，而检测方法则是影响水果进出口贸易通关速度和时间的关键，因此对其检测方法的研究极其重要。现有的检测番石榴实蝇的方法主要有以下几种：(1)形态鉴定检测：早期对番石榴实蝇的鉴定主要应用传统的成虫形态鉴定方法，而通常口岸或其他渠道截获的大部分是幼虫或卵，通常的做法是室内饲养获得成虫后，再进行形态鉴定，而饲养成虫需要较长的时间，实蝇形态鉴定的周期一般情况下约需15～25天，检测周期较长，因此传统的成虫形态鉴定并不利于口岸快速检验通关的实际需求；(2)声波检测：不同的声波频谱特征可反映各种虫声所特有的信息，声波检测中关于器械灵敏度与抗外界噪声干扰的矛盾问题，一直成为该技术发展的一个瓶颈；(3)分子检测：害虫的分子鉴定具有快速、准确、客观和对样品要求低等诸多特点，可对形态鉴定起补充作用。自90年代TaqMan探针诞生以来，虽然荧光探针(引物)不断有新的技术出现，但是作为一种经典的定量PCR技术，TaqMan探针技术仍然是许多实验研究人员进行定量检测的首选，这主要是因为相对于SYBR荧光染料，TaqMan探针具有序列特异性，只结合到互补区，而且荧光信号与扩增的拷贝数具有一一对应的关系，因此特异性强灵敏度高，而且条件优化容易；而相对于杂交探针，TaqMan探针只要设计一条探针，因此探针设计较便宜方便，而且也能完成基本的定量PCR要求，但检测番石榴实蝇的TaqMan探针未见报道。
技术实现思路
针对现有技术中存在的上述问题，本专利技术提供一种利用TaqMan探针检测番石榴实蝇的方法及检测用引物和探针，利用该引物和探针可快速、准确地对番石榴实蝇进行检测鉴定。为实现上述目的，本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：本专利技术的一方面，提供一种利用TaqMan探针检测番石榴实蝇的方法，包括以下步骤：(1)设计引物和探针：引物序列为：上游引物序列：5'-GCTAATTCATCTGTAGACATT-3'(SEQ ID No：1)；下游引物序列：5'-AATACTGCTCCTATTGATAATAC-3'(SEQ ID No：2)；TaqMan探针的序列：5'FAM-TGACACATATTATGTTGTTGCTCAT-BHQ3'(SEQ ID No：3)；其中FAM为标记在探针5'端的荧光集团，BHQ为标记在探针3'端的荧光淬灭集团；(2)采用步骤(1)设计的引物和探针进行荧光定量PCR检测。步骤(2)中荧光定量PCR检测的反应体系为10μL，包括2×TaqMan probe Supermix 5μL，上、下游引物各0.4μL，TaqMan探针0.2μL，DNA模板0.5μL，去离子水补至10μL。步骤(2)中荧光定量PCR检测的反应程序为：95℃预变性10min，95℃变性10s，55.8℃退火20s(采集荧光信号)，40个循环。本专利技术的另一方面，提供一种用于检测番石榴实蝇的引物，其序列为：上游引物序列：5'-GCTAATTCATCTGTAGACATT-3'；下游引物序列：5'-AATACTGCTCCTATTGATAATAC-3'。本专利技术的第三方面，提供一种用于检测番石榴实蝇的TaqMan探针，其序列为：5'FAM-TGACACATATTATGTTGTTGCTCAT-BHQ3'；其中FAM为标记在探针5'端的荧光集团，BHQ为标记在探针3'端的荧光淬灭集团。本专利技术提供的一种利用TaqMan探针检测番石榴实蝇的方法及检测用引物和探针，具有以下有益效果：该引物和探针容易设计，特异性好，稳定性高，重复性强，灵敏度高，检测方法简单有效，易操作，检测时间短，准确率高，可快速、准确地检测出番石榴实蝇。附图说明图1为不同退火温度的Ct值结果图；图2为特异性实验扩增曲线图；图3为6个10倍系列稀释样品的荧光定量PCR扩增曲线；图4为重复性实验扩增曲线图。具体实施方式实施例11、样品模板：6份已知物种的实蝇DNA，编号分别为：1，2，3，4，5，6，样品名称分别为桔小实蝇、番石榴实蝇、具条实蝇、南瓜实蝇、川黑实蝇和瓜实蝇，其中前五个种类由四川国际旅行卫生保健中心口岸实验室提供，瓜实蝇由华南农业大学资源环境学院昆虫教研室提供，具体见表1。表1 样品信息样品编号样品名称1桔小实蝇Bactrocera dorsalis2番石榴实蝇Bactrocera correcta3具条实蝇Bactrocera scutellata4南瓜实蝇Bactrocera tau5川黑实蝇Bactrocera ater6瓜实蝇Bactrocera cucurbitae2、一种利用TaqMan探针检测番石榴实蝇的方法，包括以下步骤：(1)设计引物和探针：引物是根据番石榴实蝇DNA特异片段设计的：根据番石榴实蝇线粒体DNA序列(Genebank accession number：NC_018787)，使用Beacon Designer 6软件设计其引物和探针序列，并将设计的引物和探针在NCBI Blast比对，确认为番石榴实蝇特异性序列；引物序列为：上游引物序列：5'-GCTAATTCATCTGTAGACATT-3'；下游引物序列：5'-AATACTGCTCCTATTGATAATAC-3'；TaqMan探针的序列：5'FAM-TGACACATATTATGTTGTTGCTCAT-BHQ3'；其中FAM为标记在探针5'端的荧光集团，BHQ为标记在探针3'端的荧光淬灭集团；(2)采用步骤(1)设计的引物和探针进行荧光定量PCR检测：反应体系为10μL，包括2×TaqMan probe Supermix 5μL，上、下游引物各0.4μL(引物终浓度分别为200nmol/L)，TaqMan探针0.2μL(探针终浓度为100nmol/L)，DNA模板0.5μL，去离子水补至10μL；反应程序为：95℃预变性10min，95℃变性10s，合适温度退火20s(采集荧光信号)，40个循环。实施例2荧光定量PCR实验中退火温度的优化选取的退火温度分别为：55.8℃、56.8℃、57.8℃、58.8℃，观察其差异，不同的退火温度，其循环阈值(Ct)结果见表2和图1。表2 不同退火温度时的Ct值退火温度(℃)Ct55.814.9056.815.2157.815.8158.816.45由结果可知，同一浓度的番石榴实绳DNA模板在不同的退火温度下，其循环阈值(Ct)不同，退火温度本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种利用TaqMan探针检测番石榴实蝇的方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）设计引物和探针：引物序列为：上游引物序列：5'‑GCTAATTCATCTGTAGACATT‑3'；下游引物序列：5'‑AATACTGCTCCTATTGATAATAC‑3'；TaqMan探针的序列：5'FAM‑TGACACATATTATGTTGTTGCTCAT‑BHQ3'；其中FAM为标记在探针5'端的荧光集团，BHQ为标记在探针3'端的荧光淬灭集团；（2）采用步骤（1）设计的引物和探针进行荧光定量PCR检测。
【技术特征摘要】
1.一种利用TaqMan探针检测番石榴实蝇的方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）设计引物和探针：引物序列为：上游引物序列：5'-GCTAATTCATCTGTAGACATT-3'；下游引物序列：5'-AATACTGCTCCTATTGATAATAC-3'；TaqMan探针的序列：5'FAM-TGACACATATTATGTTGTTGCTCAT-BHQ3'；其中FAM为标记在探针5'端的荧光集团，BHQ为标记在探针3'端的荧光淬灭集团；（2）采用步骤（1）设计的引物和探针进行荧光定量PCR检测。2.根据权利要求1所述的利用TaqMan探针检测番石榴实蝇的方法，其特征在于，步骤（2）中所述荧光定量PCR检测的反应体系为10µL，包括2×TaqMan probe Supermix 5µL，上、下游引物各0.4µL...
【专利技术属性】
技术研发人员：赵锋，钟玮，邓晓东，刘杨，高国龙，田绿波，
申请(专利权)人：四川国际旅行卫生保健中心，
类型：发明
国别省市：四川;51
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