本发明专利技术提供一种利用Taqman MGB探针检测绵羊FecB基因多态性的方法，能高通量检测A、G位点，结果容易判读。与传统的PCR-RFLP检测FecB基因等方法相比，每次可以检测384个样品，且不需要进行PCR产物的后续分析，在节省了检测成本的同时，大大缩短了检测周期，提高了检测效率。本发明专利技术使用的引物和探针特异性强，不会受到其他基因的干扰，降低了PCR产物污染引起假阳性的风险，并且结果判读更容易。可对FecB基因的SNP位点实现高通量检测，在对绵羊进行大规模分子育种中具有潜在的应用价值。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及分子标记检测技术，具体地说，涉及一种利用TaqmanMGB探针检测绵 羊FecB基因多态性的方法。
技术介绍
家畜的产仔数是经济价值十分巨大的数量性状。对绵羊产羔数的选择不仅受到性 别和年龄的限制，而且绵羊的产羔数是一个遗传力很低的数量性状，因此难以用常规的育 种技术来改良产羔数性状。标记辅助选择能够通过影响选择的时间、选择的强度和准确性 而极大地提高这类低遗传力性状的选择功效，而找到与这些数量性状基因座相连锁的分子 遗传标记，则是实现标记辅助选择的先决条件。 上世纪50年代，Seears兄弟选育出一群可以生多胞胎的澳大利亚美利奴 (BooroolaMerino,BM)，并报道这种产多胞胎的美利奴绵羊比其他群体的美利奴绵羊 产盖数提高了 30%。该基因已被绵羊和山羊遗传命名委员会定名为FecB(Fecundity Booroola)。Montgomery等用遗传连锁和微卫星标记定位的方法将FecB基因定位于 Booroola羊的第6号常染色体上。最终研宄者发现绵羊FecB的影响是由于骨形态发生蛋 白受体lB(Bonemorphogeneticproteinreceptor1B，BMPR1B)基因编码区发生了A746G 突变，从而引起第249位氨基酸由谷氨酰胺变为精氨酸（Q249R)。1个FecB拷贝增加排卵 数1. 3-1. 6枚，母羊产羔数增加0. 9-1. 2只；2个FecB拷贝增加排卵数2. 7-3. 0枚，母羊产 羔数增加1. 1-1. 7只。 由于FecB基因能提高绵羊繁殖力，可带来巨大的经济利益，因此各地展开了对 不同绵羊品种FecB基因检测。目前研宄表明FecB突变存在于世界各地各种高繁殖力绵 羊品种中。我国的湖羊和小尾寒羊均携带此突变。传统的FecB基因检测方法，大多采用 PCR-RFLP(polymerasechainreaction-restrictionfragmentlengthpolymorphism)和 PCR-SSCP(polymerasechainreaction-singlestrandconformationpolymorphism)检 测方法，这些方法通量较低，程序繁多，较难实现高通量自动化测定。 在PCR反应系统中加入2种不同荧光标记的探针，它们可分别与2个等位基因完 全配对。正常情况下，由于探针5'端荧光基团和3'端淬灭基团紧邻在一起，荧光被淬灭。 随着PCR的有效进行，与模板完全配对的探针逐步被TaqDNA聚合酶5' - 3'外切酶活性 切割，致使探针5'端上的荧光基团与3'端的淬灭基团分离，淬灭效应解除，报告荧光基 团被激活；而与模板不能完全配对的探针，表明另一对等位基因不能被有效切割，故检测不 到荧光信号，通过相应仪器检测荧光值的变化即可实现SNP位点检测。 单核苷酸多态性（singlenucleotidepolymorphism,SNP)主要指在基因组水平 上，由单个核苷酸变异引起的DNA序列多态性。是一种十分理想、有效的分子标记。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种利用TaqmanMGB探针检测绵羊FecB基因多态性的方 法。 为了实现本专利技术目的，本专利技术的一种检测绵羊多胎主效基因FecB基因型的方法， 其是对绵羊第6号染色体上第29382188bp位点（NC_019463. 1，基于绵羊基因组序列信息版 本号Oar_v3. 1，2012年12月）的核苷酸进行单核苷酸多态性检测，根据检测结果判定绵羊 FecB基因为AA、AG或GG。本专利技术中单核苷酸多态性检测所采用的方法为TaqmanMGB探针 法。 本专利技术首先提供用于检测绵羊FecB基因型的引物和探针： 所述引物的核苷酸序列如下： 正向引物：5' -ACTGCGTGGGCCATCTTGTCTG-3' 反向引物：5 ' -TTCCTGGCCGCCTATGTGTAITTC-3， 所述探针的核苷酸序列如下： P-G:5' -F1-AAATATATCGGACGGTGTT-MGB-3' P-A:5' -F2-AAATATATCAGACGGTGTTG-MGB-3' 其中，F1和F2为不同颜色的荧光报告基团。优选地，F1为FAM，F2为HEX。 本专利技术还提供含有所述引物和探针的用于检测绵羊FecB基因型的试剂盒。 优选地，所述试剂盒还包括dNTPs、TaqDNA聚合酶、Mg2+、PCR反应缓冲液中的一种 或多种。 更优选地，所述试剂盒还包括标准阳性模板。 本专利技术的利用TaqmanMGB探针检测绵羊FecB基因多态性的方法，包括以下步骤： 1)提取待测绵羊的基因组DNA ; 2)以待测绵羊的基因组DNA为模板，利用前述的引物和探针，进行实时荧光定量 PCR反应； 3)根据检测到的荧光信号对绵羊FecB基因型进行判定。 其中，步骤2)中实时荧光定量PCR反应使用的扩增体系以6ul计为：基因组 DNAlyL，2XMasterMix3yL，10ymol/L正向引物 0.3yL，10ymol/L反向引物 0.3yL; 10ymol/L探针P-G0? 15yL，10ymol/L探针P-A0? 15yL，去离子水补齐至 6yL。 实时荧光定量PCR反应的扩增程序为：95°C 10min，95°C 30sec，60°C lmin，40个循 环。 本专利技术进一步提供所述方法在绵羊分子标记辅助育种中的应用。 本专利技术提供的检测绵羊多胎主效基因FecB基因型的方法，是以绵羊基因组DNA为 模板，在体系中同时加入上述引物和探针。引物用于等位基因PCR扩增，上述探针中加入了 2种不同荧光标记，可分别与2个等位基因完全配对。正常情况下，由于探针5'端荧光基 团和3'端淬灭基团紧邻在一起，荧光被淬灭。随着PCR的有效进行，与模板完全配对的探 针逐步被TaqDNA聚合酶5' -3'外切酶活性切割，致使探针5'端上的荧光基团与:V 端的淬灭基团分离，淬灭效应解除，报告荧光基团被激活；而与模板不能完全配对的探针， 表明另一对等位基因不能被有效切割，故检测不到荧光信号，由此检测荧光值的变化即可 进行单核苷酸多态性检测，根据检测结果判定绵羊FecB基因为AA、AG或GG;其中，单核苷 酸多态性检测是针对绵羊第6号染色体上位于29382188bp位点的核苷酸。 本专利技术提供的利用TaqmanMGB探针检测绵羊FecB基因多态性的方法，能高通量 检测A、G位点，结果容易判读。与传统的PCR-RFLP检测FecB基因等方法相比，每次可以 检测384个样品，且不需要进行PCR产物的后续分析，在节省了检测成本的同时，大大缩短 了检测周期，提高了检测效率。本专利技术使用的引物和探针特异性强，不会受到其他基因的干 扰，降低了PCR产物污染引起假阳性的风险，并且结果判读更容易。可对FecB基因的SNP 位点实现高通量检测，在对羊进行大规模分子育种中具有潜在的应用价值。【附图说明】 图1为本专利技术当前第1页1 2 本文档来自技高网...
【技术保护点】
用于检测绵羊FecB基因型的引物和探针，其特征在于，所述引物的核苷酸序列如下：正向引物：5’‑ACTGCGTGGGCCATCTTGTCTG‑3’反向引物：5’‑TTCCTGGCCGCCTATGTGTATTTC‑3’所述探针的核苷酸序列如下：P‑G：5’‑F1‑AAATATATCGGACGGTGTT‑MGB‑3’P‑A：5’‑F2‑AAATATATCAGACGGTGTTG‑MGB‑3’其中，F1和F2为不同颜色的荧光报告基团。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：储明星，刘秋月，狄冉，胡文萍，王翔宇，王贵，潘章源，赵万民，李虎山，
申请(专利权)人：中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11
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