TaqMan-MGB探针实时荧光定量PCR技术联合检测艰难梭菌菌属基因及毒素基因的方法学建立技术

Taq?Man/MGB探针PCR技术可对粪便基因组中艰难梭菌进行菌属鉴定，同时检测毒素基因携带情况，并可判断A毒素是否存在缺失。粪便标本无需纯培养，在一个反应体系内完成菌株鉴定及毒素检测。本方法具有操作简单、重复性好、高通量检测标本、报告时间短等特点，适用临床不明原因腹泻病人病因筛查。本发明专利技术解决的技术问题是，粪便标本无需纯培养即可同时进行菌属鉴定及菌株毒素携带情况筛查，提供一种高敏感性的粪便基因组DNA中检测方法。由于传统厌氧培养不易开展，酶免方法存在方法学缺陷，该发明专利技术将明显提高艰难梭菌相关性腹泻的诊断率。同时也可用于上述疾病治疗过程中的用药监测。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术专利涉及一种新型艰难梭菌菌属基因及毒素基因的检测方法，具体采用TaqMan/MGB探针技术，通过Real-TimePCR分析系统快速进行粪便基因组DNA扩增和荧光信号检测，同时完成艰难梭菌菌属鉴定，A、B毒素基因检测及鉴别A毒素是否存在缺失。
技术介绍
艰难梭菌一直是引起医源性腹泻的主要病原体，由于广谱抗生素的大量使用以及高毒力株027/NAP1/BI (核酸分型为027，脉冲场凝胶电泳分型为NAP1，限制性内切酶分型为BI)的出现和流行，全球特别是欧洲和北美⑶I的流行暴发迅速增多，严重病例数、复发率和病死率均明显上升，耐药菌株也在增多，给该病的临床诊断和治疗提出新的挑战。诊断CDI的早期临床诊断须结合患者的不成形便和特殊气味及2个月内的抗生素使用史，或者接受鼻饲等医疗设备治疗72h后出现腹泻。目前，实验室检测艰难梭菌的方法主要为细菌的厌氧培养，通过对疑似菌落进行生化鉴定确定细菌种属。而常规厌氧培养除需要昂贵的厌氧设备，该方法对 标本留取也具有极其严格的要求(标本离体后必须放置在厌氧环境中，在有氧环境下，标本离体后30min几乎100%培养阴性)，而生化鉴定比较繁琐，更须本文档来自技高网...

【技术保护点】
本专利技术是一种方便、快速、高敏感性的在粪便基因组DNA中直接检测艰难梭菌菌属基因磷酸丙糖异构酶(tpi)及毒素基因tcdA、tcdB及tcdAT的方法，其技术核心为TaqMan/MGB探针结合实时荧光定量PCR技术，包括：基因库检索，tpi、tcdA、tcdAt、tcdB特异性序列比对，筛选特异序列，引物和探针设计，PCR反应参数优化。其特征在于：粪便标本无需纯培养，直接检测粪便DNA中艰难梭菌tpi、tcdA、tcdAt和tcdB基因，可从菌属鉴定、毒素鉴定及A毒素是否有缺失3个方面对艰难梭菌进行同时鉴定判断，具有灵敏度高、特异性强，检测时间短(1.5小时)、操作简单、重复性好、高通量等特...

【技术特征摘要】
1.本发明是一种方便、快速、高敏感性的在粪便基因组DNA中直接检测艰难梭菌菌属基因磷酸丙糖异构酶(tpi)及毒素基因tcdA、tcdB及tcdAT的方法,其技术核心为TaqMan/MGB探针结合实时荧光定量PCR技术，包括:基因库检索，tp1、tcdA、tcdAt、tcdB特异性序列比对，筛选特异序列，引物和探针设计，PCR反应参数优化。其特征在于:粪便标本无需纯培养，直接检测粪便DNA中艰难梭菌tp1、tcdA、tcdAt和tcdB基因,可从菌属鉴定、毒素鉴定及A毒素是否有缺失3个方面对艰难梭菌进行同时鉴定判断，具有灵敏度高、特异性强，检测时间短(1.5小时)、操作简单、重复性好、高通量等特点。2.根据权利要求1所述本发明是检测艰难梭菌菌属基因(tpi)及毒素基因tcdA、tcdB及tcdAT的新方法，其特征在于:基因库检...

【专利技术属性】
技术研发人员：梁国威，邵冬华，
申请(专利权)人：航天中心医院，
类型：发明
国别省市：