一种鉴别杂菌中幽门螺杆菌的分子检测方法技术

本发明专利技术涉及杂菌中目标细菌的分子鉴定方法，主要用于从杂菌中鉴别出幽门螺旋杆菌。所述的方法以TaqMan探针实时荧光PCR为基础，选取细菌16srRNA基因保守区域设计一对通用引物，在同一区域再设计一对长度超出保守区的幽门螺杆菌特有的引物，使用同一条荧光探针，以此从杂菌中鉴别出幽门螺旋杆菌。本发明专利技术可以有效地避免假阴性的结果出现，为特别菌种鉴别相关研究提供了更加可靠的技术保障。

【技术实现步骤摘要】
一种鉴别杂菌中幽门螺杆菌的分子检测方法本专利技术涉及杂菌中目标细菌的分子鉴定方法，具体涉及幽门螺旋杆菌的鉴别。
技术介绍
幽门螺杆菌(HP)现有的检测方法，包括快速尿素酶试验(RUT)、细菌培养、13C-尿素呼气试验(13C-UBT)、血清学(幽门螺杆菌抗体HPIgG)检查、HP病理组织学检测等方法，其中准确度以细菌培养最高，敏感度以RUT最高。而PCR法无论在方法的灵敏度还是准确度上都是以上几种方法无法企及的。荧光PCR法相较于普通PCR法更加方便快速。荧光PCR扩增时在加入一对引物的时再混入一个特异性的荧光探针，探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5′-3′外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而使荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。MGB探针又是在MGB探针技术基础上进一步改良而成的。探针的3′端带有小沟结合物(MGB)分子。探针与靶点结合后，MGB分子结合DNA内形成的小沟，提高了探针的熔解温度值，从而增强了探针的结合能力。MGB探针的长度可以大大短于PCR引物。由于MGB基团的存在，这些探针可以较TaqMan探针更短，同时能够达到较高的熔解温度。与引物相比，MGB探针能在更高的温度下，与靶点更特异性地结合。由于MGB探针具有更高的特异性，能增加检测的准确性。因此其被推荐应用于复杂领域。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种在杂菌中鉴别出幽门螺旋杆菌的方法。本专利技术建立了TaqMan探针实时荧光PCR的方法。在合适的温度下，荧光探针会优先与模板结合，同时在扩增过程中具有外切活性的Taq酶将能探针分解，从而放出荧光信号，据此可以判定出样品中是否含有幽门螺旋杆菌。本专利技术实现预期目的的思路：(1)选取细菌16srRNA基因保守区域设计一对通用引物，在同一区域再设计一对长度超出保守区的幽门螺杆菌特有的引物。(2)在靠近上游引物的一端设计出一条含有12个碱基MGB探针；(3)实验体系分为两部分，两对引物分开扩增，其他成分一致。本实验具体步骤如下：(1)探针(Probe)：FAM-5′ACGAGCGCAACC-MGB-NFQ(2)通用引物(Primers)CB：F5′TCGTCAGCTCGTGYCGTGA3′R5′ATGMTGACTTGACGTCRTCCC3′幽门螺旋杆菌引物CB-HP：F5′GCTTGCCAGACCTTGAAAA3′R5′ATGATGACTTGACGTCGTCCC3′(3)体系成分构成：(4)选用两步法扩增，程序步骤如下：依据上述步骤可以得到样品中是否含有细菌，并进一步鉴别是否含有幽门螺杆菌。与现有技术相比，所述技术方法采用荧光PCR法，将特定菌株辨别的灵敏度和准确度提升的一个新的高度。若通用引物没有信号只能说明样品提取不合格，任何结果都不可信，也不能判读为幽门螺杆菌为阴性。这样设计可以有效地避免假阴性的结果出现，为特别菌种鉴别相关研究提供了更加可靠的技术保障。附图说明图1为通用引物CB的扩增曲线图2为HP特异引物的扩增曲线图具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术进行进一步描述，但本专利技术的保护范围并不仅限于此。实施例1：提取大肠杆菌和幽门螺杆菌的DNA提取物为阳性对照品。利用本专利技术中细菌的通用引物，分别检测这两个阳性对照品，结果如图1：大肠杆菌(CtE.coli＝14)和幽门螺旋杆菌(CtHP＝15)相较于阴性对照(CtNegative＝31)荧光信号明确，灵敏度高，说明该对通用引物和探针设计合理，达到了预期效果。实施例2：为了验证引物CBHP是否能扩增出幽门螺旋杆菌特异性片段，使用实施例一中两种菌的DNA提取物，结果如图2：幽门螺旋杆菌(CtHP＝14)相较于阴性对照(CtNegative＝31)荧光信号强烈明确。大肠杆菌(CtE.coli＝30)与阴性对照基本相近，说明HP特异引物并不能扩增出条带，达到了引物设计初衷，取得了很好的判别幽门螺旋杆菌的效果。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种鉴别杂菌中幽门螺杆菌的分子检测方法，其特征在于，建立了TaqMan探针实时荧光PCR的方法，使用一条

【技术特征摘要】
1.一种鉴别杂菌中幽门螺杆菌的分子检测方法，其特征在于，建立了TaqMan探针实时荧光PCR的方法，使用一条探针、一对能够扩增大部分细菌的引物和一对只能扩增幽门螺旋杆菌的引物，对混合样本中的幽门螺杆菌进行鉴定。2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述荧光探针是一段含有12个碱基的脱氧核糖核苷酸序列，5′端由FAMTM染料标记，为报告基因，而3′端结合了小沟结合物(minorgroovebinder，MGB)与非荧光性淬灭基团(NFQ)。3.根据权利要求1所述的检测方法，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨宁敏，徐莹洁，
申请(专利权)人：杭州致远医学检验所有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33