本发明专利技术公开了一种三文鱼中磷脂分子的检测方法，包括以下步骤：1)、样品前处理：将三文鱼肉洗净后研磨成糜，在三文鱼肉糜中加入有机溶剂Ⅰ后震荡混匀；超声冰浴提取，提取完毕后向加入纯水并震荡混匀；所得的混合物用冷冻离心机离心，移取下相溶液，将该下相溶液低温干燥后，用有机溶剂Ⅱ复溶，得脂质粗提物；2)、富集和净化：先对固相萃取柱进行活化处理；然后将脂质粗提物经上样、淋洗、洗脱；所收集的洗脱液为磷脂提取液；3)、将磷脂提取液进行质谱检测分析。采用本发明专利技术的方法能实现对三文鱼中磷脂酰胆碱(PC)和磷脂酰乙醇胺(PE)两大类磷脂的结构鉴定和定量分析。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于食品检测领域，涉及三文鱼中磷脂分子的检测方法，具体指一种三文鱼中磷脂酰胆碱(PC)和磷脂酰乙醇胺(PE)两大类磷脂的结构鉴定和定量分析方法。
技术介绍
三文鱼是生长在挪威、美国和加拿大等高纬度地区的鲑科种类，属于冷水性的洄游鱼类。其肉质细嫩，口感鲜美，肉色一般呈红色或橘色，是鱼类中的珍品。三文鱼营养价值极高，富含脂溶性维他命A及D以及水溶性维他命B12及维他命B6，也是-3不饱和脂肪酸的重要来源，其蛋白质含量高，胆固醇和热量含量低，是全世界餐桌上的高档水产品之一。食用三文鱼能有效防治心脑血管疾病，缓解血管炎症和安抚神经功效，还可预防糖尿病等疾病，三文鱼的食用价值和保健价值，已被越来越多的人们所认识。磷脂是一类含有磷酸的脂类。磷脂结构主要由甘油骨架、极性基团和不同长度和饱和度的脂肪酸链组成。根据磷脂极性基团不同，可将磷脂分为磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺等类别。生物体中存在的磷脂种数以千计，结构多样、种类复杂，具有独特的化学结构。磷脂是维持细胞结构的重要组成部分，也是新陈代谢不可或缺的营养元素。磷脂还具备广泛的生物学功能，诸如活化细胞，维持代谢与荷尔蒙分泌均衡，增强人体免疫力等。实验证明，磷脂可以分解血脂、胆固醇，阻止多余脂肪在血管壁沉积，使血管循环顺畅，被誉为“血管清道夫”。高效的三文鱼中磷脂分子的检测方法将有利于深化三文鱼中磷脂的营养学研究，促进三文鱼为原料的产品开发。常规磷脂提取方法主要为液液萃取和C18固相萃取，磷脂的特异性吸附较差，导致提取物中含有较多杂质。传统磷脂检测方法包括高效液相色谱(HPLC)、核磁共振波谱(NMR)、荧光光谱(FLR)等，这些方法分析耗时长、灵敏度低。质谱技术已经成为当前磷脂研究的主流技术手段，基质辅助激光解吸/飞行时间串联质谱法已被证实是一种快速有效的分析手段，每个样品的分析可以控制在几秒钟以内。建立基质辅助激光解吸/飞行时间串联质谱法，快速分析三文鱼肌肉组织中磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺分子种，有利于深化三文鱼营养学认识。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种操作简便、定性定量能力较强的三文鱼中磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺的基质辅助激光解吸/飞行时间串联质谱检测方法。为了解决上述技术问题，本专利技术提供一种三文鱼中磷脂分子的检测方法，包括以下步骤：1)、样品前处理：将三文鱼肉洗净后研磨成糜，在三文鱼肉糜中加入有机溶剂Ⅰ后震荡混匀；超声(探头式超声)冰浴提取(提取时间为10～20分钟)，提取完毕后向加入纯水并震荡混匀；所得的混合物用冷冻离心机离心，移取下相溶液，将该下相溶液低温(≤10℃)干燥后(用氮气进行低温吹干)，用有机溶剂Ⅱ复溶，得脂质粗提物；有机溶剂Ⅰ为甲醇：氯仿＝1：0.5～2体积比的混合液，三文鱼肉糜与有机溶剂Ⅰ的料液比为1g/15～30ml；所加入纯水的量为有机溶剂Ⅰ的0.5～1体积倍；所述有机溶剂Ⅱ为体积浓度≥30％(较佳为≥70％)的甲醇水溶液或甲醇；2)、富集和净化：先对固相萃取柱进行活化处理(通过使用有机溶剂水溶液实现活化)；然后将脂质粗提物经上样、淋洗、洗脱；所收集的洗脱液为磷脂提取液；3)、将磷脂提取液进行质谱检测分析。作为本专利技术的三文鱼中磷脂分子的检测方法的改进：所述步骤3)为：将磷脂提取液与DHB基质等体积比混合后的所得物在点样板上点样，于空气中干燥结晶后进行质谱分析；正离子反射模式，加速电压20kV，离子萃取时间延迟450ns，扫描范围为450～1000m/z；质谱数据采集使用4000Series Explorer，所有谱图均经同位素校正，确保微量磷脂的离子峰不受其他高浓度磷脂离子峰干扰。备注说明：同位素校准属于常规方式，例如可由4000Series Explorer这个软件完成的，具体操作为选择Peaks选项，Peak Deisotoping选项，Adduct选择为H。作为本专利技术的三文鱼中磷脂分子的检测方法的进一步改进：所述步骤1)中，以移取下相溶液后的离心所得物(即，包括上相溶液和固体)替代三文鱼肉糜，以机溶剂Ⅰ中的氯仿替代机溶剂Ⅰ；再重复提取1～3次；将所有提取后所得的下相溶液合并后进行后续的干燥和复溶。备注说明：离心后离心管内溶液上下分层，三文鱼肌肉组织样品则呈饼状居于两相中间。甲醇、氯仿、水三者在一起的时候不会混溶，会分成上下两相，甲醇极性较强会与水混溶，因此在离心管中，氯仿混溶少量甲醇在下相，水混溶多量甲醇在上相；由于移取走下相
后，实际大部分甲醇依然在上相中并未被移取，因此重复提取的时候只需要加入氯仿即可。即，重复提取时氯仿的体积用量＝机溶剂Ⅰ中的氯仿的体积用量。作为本专利技术的三文鱼中磷脂分子的检测方法的进一步改进：所述步骤1)中超声条件为25kHz。作为本专利技术的三文鱼中磷脂分子的检测方法的进一步改进：所述步骤2)中，有固相萃取柱填料为二氧化硅/二氧化钛壳核复合材料；淋洗液为有机溶剂Ⅲ水溶液或水，有机溶剂Ⅲ水溶液中有机溶剂Ⅲ的体积浓度≤10％，有机溶剂Ⅲ为甲醇、乙腈；洗脱液为有机溶剂Ⅳ水溶液或有机溶剂Ⅳ，有机溶剂Ⅳ水溶液中有机溶剂Ⅳ的体积浓度≥75％(较佳为≥90％)，有机溶剂Ⅳ为甲醇、乙腈。作为本专利技术的三文鱼中磷脂分子的检测方法的进一步改进：所述步骤2)中，上样、淋洗和洗脱的流速均为0.2～2mL/min(优选流速为0.6mL/min)。作为本专利技术的三文鱼中磷脂分子的检测方法的进一步改进：所述步骤3)中，在点样板上的点样量为0.5～1μL。作为本专利技术的三文鱼中磷脂分子的检测方法的进一步改进：所述步骤1)中，用冷冻离心机离心为：于4℃、8000rpm离心15分钟。作为本专利技术的三文鱼中磷脂分子的检测方法的进一步改进：所述步骤1)中，三文鱼肉糜与复溶用的有机溶剂Ⅱ的料液比为1g/1～2ml。在本专利技术中，步骤1)，将三文鱼去皮、去骨、去内脏后，所得的肌肉组织三文鱼肉。所述步骤2)中，使用有机溶剂水溶液对固相萃取柱进行活化处理，可使用注射器将有机溶剂水溶液流经填料层，将流出液收集并丢弃，达到固相萃取柱活化与清洗的目的。固相萃取柱包含空管，上下筛板，筛板中间填料为二氧化硅/二氧化钛壳核复合材料。本专利技术所用的二氧化硅/二氧化钛壳核复合材料可按照发表于《Talanta》的Volume 123,June 2014,Pages 233–240，篇名为“Solid-phase extraction approach for phospholipids profiling by titania-coated silica microspheres prior to reversed-phase liquid chromatography–evaporative light scattering detection and tandem mass spectrometry analysis”的方法进行制备。二氧化钛：二氧化硅质量比为1/10，粒径为50～100um。例如具体为通过热水法合成，3.5g钛酸四丁酯溶解在14mL乙醇中，60℃下密封振荡。加入8g硅胶并搅拌至干，得到的固形物在100℃下熏蒸6小时后得到粗复合物，取1g粗复合物于反应釜中60℃维持5小时，最后将产物于500℃老
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【技术保护点】
三文鱼中磷脂分子的检测方法，其特征是包括以下步骤：1)、样品前处理：将三文鱼肉洗净后研磨成糜，在三文鱼肉糜中加入有机溶剂Ⅰ后震荡混匀；超声冰浴提取，提取完毕后向加入纯水并震荡混匀；所得的混合物用冷冻离心机离心，移取下相溶液，将该下相溶液低温干燥后，用有机溶剂Ⅱ复溶，得脂质粗提物；有机溶剂Ⅰ为甲醇：氯仿＝1：0.5～2体积比的混合液，三文鱼肉糜与有机溶剂Ⅰ的料液比为1g/15～30ml；所加入纯水的量为有机溶剂Ⅰ的0.5～1体积倍；所述有机溶剂Ⅱ为体积浓度≥30％的甲醇水溶液或甲醇；2)、富集和净化：先对固相萃取柱进行活化处理；然后将脂质粗提物经上样、淋洗、洗脱；所收集的洗脱液为磷脂提取液；3)、将磷脂提取液进行质谱检测分析。
【技术特征摘要】
1.三文鱼中磷脂分子的检测方法，其特征是包括以下步骤：1)、样品前处理：将三文鱼肉洗净后研磨成糜，在三文鱼肉糜中加入有机溶剂Ⅰ后震荡混匀；超声冰浴提取，提取完毕后向加入纯水并震荡混匀；所得的混合物用冷冻离心机离心，移取下相溶液，将该下相溶液低温干燥后，用有机溶剂Ⅱ复溶，得脂质粗提物；有机溶剂Ⅰ为甲醇：氯仿＝1：0.5～2体积比的混合液，三文鱼肉糜与有机溶剂Ⅰ的料液比为1g/15～30ml；所加入纯水的量为有机溶剂Ⅰ的0.5～1体积倍；所述有机溶剂Ⅱ为体积浓度≥30％的甲醇水溶液或甲醇；2)、富集和净化：先对固相萃取柱进行活化处理；然后将脂质粗提物经上样、淋洗、洗脱；所收集的洗脱液为磷脂提取液；3)、将磷脂提取液进行质谱检测分析。2.根据权利要求1所述的三文鱼中磷脂分子的检测方法，其特征是：所述步骤3)为：将磷脂提取液与DHB基质等体积比混合后的所得物在点样板上点样，于空气中干燥结晶后进行质谱分析；正离子反射模式，加速电压20kV，离子萃取时间延迟450ns，扫描范围为450～1000m/z；质谱数据采集使用4000Series Explorer，所有谱图均经同位素校正，确保微量磷脂的离子峰不受其他高浓度磷脂离子峰干扰。3.根据权利要求1所述的三文鱼中磷脂分子的检测方法，其特征是：所述步骤1)中，以移取下相溶液后的离心...
【专利技术属性】
技术研发人员：沈清，戴志远，金仁耀，冯俊丽，薛静，陈康，
申请(专利权)人：浙江工商大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33
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