本发明专利技术提供了一种日本血吸虫线粒体分子标记及其应用。具体地，本发明专利技术公开了一种基于ND1、ND4、和16S-12S rDNA基因序列的聚类分析结果，从而鉴定日本血吸虫(Schistosoma japonicum katsurada)样本地域株、和/或对日本血吸虫样本进行地域性种群聚类的方法。本发明专利技术方法简便、准确，且稳定性高，对于鉴定血吸虫病患者的原始感染地，判断病例是原发型还是输入型有很大帮助。也为日本血吸虫病的监测和流行现状的研究提供了支持。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物技术和遗传学领域，具体地说，本专利技术涉及一种利用线粒体基因作为分子标记鉴定日本血吸虫群体的方法以及线粒体分子标记在日本血吸虫群体遗传学中的应用。
技术介绍
日本血吸虫病是一种严重威胁人类健康的人畜共患病，全球每年因日本血吸虫病死亡人数约28万。经过几十年的努力，我国血吸虫病防治工作取得了举世瞩目的成就，然而目前我国仍有现症感染人群约30万，尤其是目前大量人口流动，加之人们对血吸虫病防范意识松懈，导致我国血吸虫病防治形势不容乐观，防治任务依然艰巨。日本血吸虫在东南亚地区流行多年，在不同流行区具有明显的遗传多样性，不同地域群体间有着多种不同的遗传分化或变异。其中，目前受到广泛认可的东南亚流行区分型大致可以分为以中国台湾、日本、印尼等为主的岛屿型、以中国四川、云南、贵州等区域为主的山区型、以及以中国湖北、湖南、安徽等区域为主的湖区型。其中，除岛屿型中台湾株日本血吸虫不具有人类致病性(但可感染牛等家畜)，其他各型均对人类具有致病性。然而，由于种属相同，不同流行类型的日本血吸虫很难通过大体外形进行所属地域来源的区分。在实现我国2015年达到全国血吸虫病传播阻断关键时期以及之后很长一段时间内，对血吸虫病流行进行监测是评估和评价防治成果的必要措施，而发展鉴别日本血吸虫地域性来源的技术可为血吸虫病流行监测提供有效地技术手段。近年来，众多的分子标记被应用于日本血吸虫的群体地域遗传研究中，如等位酶、限制性片段长度多态性(RFLP)、随机扩增多态性(RAPD)、微卫星(STR)等。然而，尚没有一种能够鉴别日本血吸虫地域株，尤其是将台湾型(即非致病株型)与其他地域株型鉴别开的有效方法。因此，本领域迫切需要开发一种新的鉴定日本血吸虫地域株型或将日本血吸虫进行地域性种群聚类的方法。
技术实现思路
本专利技术利用特定的线粒体基因组合，可以有效鉴别日本血吸虫的地域株型。本专利技术第一方面，提供了一种鉴定日本血吸虫(schistosoma japonicum katsurada)样本地域株、和/或对日本血吸虫样本进行地域性种群聚类的方法，包括步骤：(i)对一个和/或多个样本中以下三种线粒体基因进行测序：NADH脱氢酶1(ND1)、NADH脱氢酶4(ND4)、和16S-12S rDNA基因；(ii)将步骤(i)中的测序结果与日本血吸虫标准数据库中的地域株参考序列信息进行多序列联配，并利用所获的比对信息进行聚类分析；(iii)根据(ii)中的聚类分析结果获得所述样本的地域株鉴定结果、和/或所述样本地域性种群的聚类结果。在另一优选例中，所述的日本血吸虫样本包括虫卵、毛蚴、尾蚴、和/或成虫样本。在另一优选例中，当所述的样本为一个时，所述的方法包括将样本的测序结果与日本血吸虫标准数据库中的地域株参考序列信息进行比对，从而用于鉴定所述样本所属的地域株；和/或当所述的样本为多个时，所述的方法包括将多个样本的测序结果同时与日本血吸虫标准数据库中的地域株参考序列信息进行多序列联配，从而用于对日本血吸虫样本进行地域性种群聚类。在另一优选例中，步骤(i)中的测序为对三种线粒体基因同时进行测序。在另一优选例中，步骤(iii)中的聚类分析结果包括所述样本测序结果与标准数据库序列信息之间的距离；其中，当样本与参考序列信息之间和/或多个样本之间的距离越近，则表明所述样本与参考序列所属地域株之间和/或多个样本之间的地域性越接近。在另一优选例中，所述的距离包括所述样本测序结果与参考序列信息之间的碱基差异度或差异量。在另一优选例中，步骤(iii)中的聚类分析结果包括样本与参考序列信息之间和/或多个样本之间的进化树信息。在另一优选例中，所述的进化树信息的构建如下：根据步骤(ii)中的比对 信息，利用最大似然法(Maximum Likelihood,ML)构建进化树信息。在另一优选例中，所述最大似然法采用HKY模型。在另一优选例中，所述的进化树信息包括进化树的分支长度、和/或分支点的Bootstrap值。在另一优选例中，所述标准数据库中的地域株参考序列信息包括来自岛屿型、湖区型、和/或山区型的日本血吸虫序列信息。在另一优选例中，所述岛屿型日本血吸虫序列信息包括中国台湾(TW)型、印度尼西亚(IN)型、日本(JP)型、菲律宾(PH)型。在另一优选例中，所述湖区型日本血吸虫序列信息包括安徽贵池(AHGC)、安徽铜陵(AHTN)、湖南岳阳(HNYY)、湖南常德(HNCD)、湖北沙市(HBSH)、江西都昌(JXDC)。在另一优选例中，所述山区型日本血吸虫序列信息包括云南洱源(YNEY)、四川西昌(SCXC)。在另一优选例中，所述标准数据库中的参考序列信息如SEQ ID NO.:7-30所示，其中，SEQ ID NO.:7-12所示的序列为ND1基因，SEQ ID NO.:13-18所示的序列为ND4基因，SEQ ID NO.:19-24所示的序列为16s-rDNA基因，SEQ ID NO.:25-30所示的序列为12s-rDNA基因，所属的地域按顺序分别为湖区代表安徽贵池型、山区代表云南洱源型、中国台湾型、印尼型、日本型、菲律宾型。本专利技术第二方面，提供了一种引物组合，所述的引物组合用于扩增以下三个日本血吸虫的线粒体基因：ND1、ND4、和16S-12S rDNA基因。在另一优选例中，所述的引物组合中的引物如SEQ ID NO.:1-6所示。(ND1-F：5’-TTGGAGTTTGTCAGGCTTTAGG(SEQ ID NO.:1) ND1-R：5’-TATATCAAACACCATCAAAAGGAAC(SEQ ID NO.:2) ND4-F：5’-TGCTGTTTTATGCTATGCTACGAAG(SEQ ID NO.:3) ND4-R：5’-TACAAACGGACGGACCAATAAAAC(SEQ ID NO.:4) rDNA-F：5’-ATAATGTTGCGTCTAAGGTC(SEQ ID NO.:5) rDNA-R：5’-TAAACACTACCCATCAAATC(SEQ ID NO.:6))本专利技术第三方面，提供了日本血吸虫线粒体基因组合和/或本专利技术第二方面所述引物组合的用途，用于制备鉴定日本血吸虫样本地域株、和/或对日本血吸虫样本进行地域性种群聚类的试剂盒；其中，所述的日本血吸虫线粒体基因组合含有：ND1、ND4、和16S-12S rDNA基因。本专利技术第四方面，提供了一种试剂盒，所述的试剂盒含有本专利技术第二方面所述的引物组合。本专利技术第五方面，提供了本专利技术第四方面所述试剂盒的用途，用于鉴定日本血吸虫样本地域株、和/或对日本血吸虫样本进行地域性种群聚类。应理解，在本专利技术范围内中，本专利技术的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。附图说明图1显示了12个流行区(安徽贵池、安徽铜陵、湖南岳阳、湖南常德、湖北沙市、江西都昌、四川西昌、云南洱源、中国台湾及日本、菲律宾、印度尼西亚)日本血吸虫样本线粒体基因ND1序列比对结果，其中以色块标示出的是存在核苷酸多态性的位点。图2显示了12个流行区的日本血吸虫样本3个线粒体基因(ND1，ND4和16-12S rDNA)本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种鉴定日本血吸虫(Schistosoma japonicum katsurada)样本地域株、和/或对日本血吸虫样本进行地域性种群聚类的方法，其特征在于，包括步骤：(i)对一个和/或多个样本中以下三种线粒体基因进行测序：NADH脱氢酶1(ND1)、NADH脱氢酶4(ND4)、和16S‑12S rDNA基因；(ii)将步骤(i)中的测序结果与日本血吸虫标准数据库中的地域株参考序列信息进行多序列联配，并利用所获的比对信息进行聚类分析；(iii)根据(ii)中的聚类分析结果获得所述样本的地域株鉴定结果、和/或所述样本地域性种群的聚类结果。
【技术特征摘要】
1.一种鉴定日本血吸虫(Schistosoma japonicum katsurada)样本地域株、和/或对日本血吸虫样本进行地域性种群聚类的方法，其特征在于，包括步骤：(i)对一个和/或多个样本中以下三种线粒体基因进行测序：NADH脱氢酶1(ND1)、NADH脱氢酶4(ND4)、和16S-12S rDNA基因；(ii)将步骤(i)中的测序结果与日本血吸虫标准数据库中的地域株参考序列信息进行多序列联配，并利用所获的比对信息进行聚类分析；(iii)根据(ii)中的聚类分析结果获得所述样本的地域株鉴定结果、和/或所述样本地域性种群的聚类结果。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，当所述的样本为一个时，所述的方法包括将样本的测序结果与日本血吸虫标准数据库中的地域株参考序列信息进行比对，从而用于鉴定所述样本所属的地域株；和/或当所述的样本为多个时，所述的方法包括将多个样本的测序结果同时与日本血吸虫标准数据库中的地域株参考序列信息进行多序列联配，从而用于对日本血吸虫样本进行地域性种群聚类。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(iii)中的聚类分析结果包括所述样本测序结果与标准数据库序列信息之间的距离；其中，当样本与参考序列信息之间和/或多个样本之间的距离越近，则表明所述样本与参考序列所属地域株之间和/或多个样本之间的地域性越接近。4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(iii)中的聚类分析结果包括样本与参考序列信息之间和/或多个样本之间的进化树信息。5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，...
【专利技术属性】
技术研发人员：胡薇，徐斌，冯正，殷明波，李鸿雁，郑鸿翔，莫筱瑾，
申请(专利权)人：中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所，复旦大学，
类型：发明
国别省市：上海;31
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