检测和杀伤上皮癌细胞的方法技术

一种通过选择性标记癌细胞线粒体，通过将阳离子超活体线粒体标记剂递送至上皮而检测癌性上皮细胞诊断方法。通过将阳离子超活体线粒体标记剂递送至上皮癌细胞，实现在正常细胞存在的情况下选择性杀伤癌性上皮细胞的目的。该杀伤剂还可以包含标记剂和癌化学治疗药物的反应产物或者与药物的混合物。（*该技术在2021年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
检测和杀伤上皮癌细胞的方法相关申请本申请是未决的国际申请PCT/US00/05387的部分继续，国际申请于2000年2月28日递交，名称为“检测和杀伤上皮癌细胞的方法”。本专利技术的另一方面是涉及选择性杀伤上皮癌细胞的方法。在更进一步的方面，本专利技术涉及在正常细胞存在的情况下检测上皮癌细胞和/或选择性杀伤这种细胞的方法，其中癌细胞线粒体在足够长的时间内保留线粒体标记剂，以识别和/或杀伤这种细胞。定义本文使用的下列术语具有所指出的含义“癌”或“癌性的”细胞在广义上使用，包括入侵的癌细胞，原位癌细胞和严重发育异常的细胞。“线粒体标记剂”意指一种化合物，其被活的癌细胞的线粒体选择性地吸收，并选择性地在癌细胞中保留足够的时间，使得识别和/或杀伤癌细胞，或使癌细胞丧失能力。“杀伤”细胞意指或者引起细胞死亡、凋亡，或者引起细胞不能繁殖和转移的改变。“加合物”意指线粒体标记剂和癌症化学治疗剂的共价或非共价反应产物。“佐剂”意指是线粒体标记剂，其与其它化学治疗剂结合，协同地或通过与其他试剂的加和作用，使杀伤癌细胞的能力提高。例如，在Chenz，中国口腔病学杂志(2744-47(1992))和Filurin(口腔病学(俄罗斯)7244-47(1993))中公开了使用荧光素和荧光素衍生物的方法。这些方法包括使用染料，接着在紫外光下检查，以检测选择性发出荧光的癌/癌变前组织。另一种现有技术的方法包括用甲苯胺蓝漂洗上皮，接着通过普通的视觉检查检测任何选择性染色的组织。这种方法已被公开，例如在Burkett(美国6,086,852)，Tucci(美国5,372,801)和Mashberg(美国4,321,251)的专利中公开。以类似的方式使用其它噻嗪染料和恶嗪染料在Pomerantz的美国专利5,882,627中公开。迄今为止，已经建立理论，认为这种染料选择性“标记”癌性组织是因为染料保留在癌性组织细胞间相对较大的间隙空间中，而不能有效地透过正常组织较紧密的细胞内连接，或选择性地保留在这种相对较小的空间中。与甲苯胺蓝因选择性保留在癌细胞间相对较大的间隙中，从而选择性标记癌上皮组织的看法相反，这种阳离子染料，例如若丹明、荧光素、恶嗪和噻嗪染料(包括甲苯胺蓝)和其它阳离子超活体标记剂选择性染色上皮组织的机制是，标记剂在癌细胞线粒体中被选择性吸收和选择性保留。这种选择性的线粒体吸收和保留明显是由于与正常细胞线粒体相比，癌细胞线粒体的较高电位(在膜内侧上的负电荷)。参见，例如Chen等，癌细胞1/改变的表型，75-85(冷泉港实验室，1984)；Lampidis等，癌症研究43，716-720(1983)。事实上，超活体阳离子染料和其它超活体阳离子标记剂对癌细胞的选择性标记和在癌细胞线粒体中的保留与癌细胞的一种特性有关，该特性看来是造成癌细胞快速克隆生长和转移能力的原因，即，癌细胞线粒体的较高电位是细胞能量的来源，是细胞产生ATP(三磷酸腺苷)的驱动力。另一方面，我们发现一种在正常细胞存在的情况下选择性杀伤癌细胞的治疗方法。我们的检测方法包含下列步骤，将阳离子超活体线粒体标记剂递送至上皮(其包含正常的和癌性的细胞)可疑癌性部位位点的组织，从而引起所述标记剂被吸收并选择性保留在癌细胞的线粒体中。然后通过任何适宜的方法检测癌细胞，例如，在可见光或所选择的不可见光下，进行仪器或视觉检查。在又一实施方案中，标记剂被线粒体吸收后，在可疑癌性部位的位点使用漂洗试剂，从而提高标记剂自正常细胞线粒体释放的速度，进而增加诊断方法的选择性。根据本专利技术的另一重要实施方案，我们提供一种选择性杀伤癌上皮细胞的方法，包括下列步骤用阳离子超活体线粒体标记剂在可疑癌性部位的位点接触癌细胞，以引起细胞死亡或使癌细胞基本上不能增殖。可以单一的不连续剂量，或连续地，或重复的不连续剂量将标记剂递送至癌细胞，每次给药后使用或不使用漂洗试剂。在本专利技术的又一实施方案中，我们提供了一种提高癌症化学治疗剂的选择性和杀伤癌细胞能力的方法，包括下列步骤或者(1)形成阳离子超活体标记剂和化学治疗剂的反应产物，并将反应产物递送至癌性上皮细胞，或者(2)将阳离子超活体标记剂与癌化学治疗剂结合，通过加和或协同效果，或二者兼有，提高化学治疗剂的选择性和杀伤能力。本专利技术的这些，其它和进一步的实施方案对本领域的技术人员是显而易见的，可以通过下列实施例更好地理解本专利技术。实施例用于说明本专利技术，而不是对其范围的限定，本专利技术的范围仅通过权利要求加以限定。在本专利技术的实践和以下操作实施例中，阳离子超活体线粒体标记剂，包括染料，包括甲苯胺蓝0，阿利辛蓝，孔雀绿，酚藏花红，吖啶黄素，焦宁Y，甲苯蓝和亮绿；和“非-染料”化合物，包括甲基花青素，羟基硫胺素，替莫碘铵，依利醋铵和呋唑氯铵。根据本专利技术目前的优选实施方案，优选的线粒体标记剂是恶嗪和噻嗪类染料。噻嗪类染料是特别优选的，尤其是甲苯胺蓝0，天青A，天青B及其环取代和N-取代类似物。为了被选择性吸收并被保留在癌细胞线粒体中，标记剂或标记剂+化学治疗剂的反应产物必须具有低于大约5,000的分子量。此外，由于各种密切相关的类似物的选择标记和治疗活性的显著差异，标记剂的分子结构似乎显著影响其在正常活细胞存在的情况下，选择标记和/或杀伤活的癌细胞的能力。这些细胞标记和杀伤能力的差异与标记剂分子的结构特点有关，例如，标记剂分子的环-取代和N-取代的类型和位置，其涉及下列作用机理中的一种、多种或全部1.标记剂分子的结构，例如，阳离子分子上环和N-取代的位置和性质，影响正电荷的有效性并阻碍标记剂或其“堆积”基团被线粒体膜上或线粒体内部的负电荷吸引。2.标记剂分子的结构使其插入癌细胞线粒体DNA或沿着癌细胞线粒体DNA的外部“堆积”。3.标记剂分子的结构使其或其堆积基团与线粒体中特异性活性位点结合，例如与4种特异性蛋白结合，和/或与线粒体膜内表面的心肌磷脂沉淀。4.标记剂的结构影响其还原电位及其变为不带电荷的“无色”形式的趋势。5.标记剂的结构影响其酸度(pKa)，而且，又影响阳离子标记剂在生理pH下脱质子的能力。这样，阳离子形式的染料可被吸引到线粒体膜的外表面，在线粒体膜上，染料阳离子可能丢失质子并伴随丢失其正电荷，由此释放中性形式的染料，其可以更容易地透过膜的非极性基质，并得以进入线粒体内部。机制1染料-膜)、2(染料-碱基对或染料-染料)、和3(染料-蛋白质或染料-脂质)的分子间相互作用取决于染料的疏水性-亲脂性，该性质可以通过各种方法评估，其中的一种方法是评估水溶液和低极性有机溶剂，如1-辛醇之间的分配系数(即，log P值)。机制4和5取决于疏水性-亲脂性，这是由于反应物和产物在还原电位(氧化形式对还原形式)和pKa(中性形式对带电形式)的不同溶剂化作用。例如，相对于仲胺(R2NH2+)，疏水性阻碍质子化叔脂肪胺(R3NH+)的溶剂化作用，由此降低它们的酸度。根据本专利技术目前的优选实施方案，使用log P值约从-1.0至5的阳离子超活体标记剂。提供下列实施例以使本领域的技术人员理解并实现本专利技术，并确定目前的优选实施方案。这些实施例仅用于说明之目的，而不限制本专利技术的范围，本专利技术的范围仅通过附加的权利要求来限定。实施例1活体癌细胞中线粒体标记剂的吸收和保留在含有20％胎本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种通过选择性标记癌上皮细胞线粒体而在体内检测癌上皮细胞的诊断方法，包括将阳离子超活体线粒体标记剂递送至上皮的步骤。

【技术特征摘要】
US 2000-2-28 PCT/US00/053871.一种通过选择性标记癌上皮细胞线粒体而在体内检测癌上皮细胞的诊断方法，包括将阳离子超活体线粒体标记剂递送至上皮的步骤。2.一种选择性杀伤上皮癌细胞的方法，包括将阳离子超活体线粒体标记剂递送至上皮癌细胞的步骤。3.根据权利要求2的方法，其中标记剂是阳离子超活体线粒体标记剂和癌化学治疗药物的反应产物。4.根据权利要求2的方法，其中标记剂和其它的癌化学治疗药物共同递送至上皮癌细胞，该癌化学治疗药物通过与标记剂杀伤癌细胞不同的机制选择性杀伤癌细胞。5.根据权利要求1或2的方法，其中对阳离子超活体线粒体标记剂进行选择以提供一种分子结构，该结构不会阻碍标记剂的正...

【专利技术属性】
技术研发人员：塞缪尔伯纳尔，道格拉斯D伯克特，拉尔夫E格林，塞斯D罗斯，
申请(专利权)人：日拉生物技术公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]