肉果草微卫星分子标记制造技术

本发明专利技术涉及一种肉果草微卫星分子标记，属DNA分子标记技术领域，其通过RAD‑seq技术从肉果草基因组DNA中分离微卫星分子标记，根据每个微卫星分子标记位点两端的侧翼序列设计该分子标记的特异性引物，对来自不同居群的肉果草个体进行PCR扩增并检测扩增结果的稳定性和多态性，获得了10个有效的微卫星分子标记。本发明专利技术开发出有效的肉果草微卫星分子标记，建立了制备肉果草微卫星分子标记的方法，并可用这些分子标记进行遗传多样性分析、植物遗传图谱的构建、基因定位、品种鉴定、种质保存、数量性状基因的分析、进化与亲缘关系研究等。

Rouguo grass microsatellite markers

The invention relates to a fruit grass microsatellite marker, which belongs to the technical field of DNA molecular marker, through the RAD SEQ from lancea tibetica genomic DNA isolation of microsatellite markers, specific primers were designed according to the molecular marker flanking sequences of each microsatellite loci at both ends, from different populations of rouguo grass individuals were amplified by PCR and detected the stability and polymorphic amplification results, obtained 10 microsatellite molecular markers effectively. The present invention developed effective fruit grass microsatellite markers, establishes the method of preparing rouguo grass microsatellite markers, and the available molecular markers for genetic diversity analysis, genetic map construction, gene localization, variety identification, germplasm conservation, QTL analysis, evolution and genetic relationship etc..

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种生物科学中的DNA分子标记技术，尤其涉及一种肉果草微卫星分子标记、引物对及其制备方法和应用。
技术介绍
微卫星分子标记又称作简单序列重复(SimpleSequenceRepeats,SSRs)，是指基因组中以1-6个核苷酸为单位串联组成的核苷酸序列。由于重复次数的不同或重复程度的不完全相同，造成了微卫星序列长度的高度变异性，由此产生了微卫星分子标记。虽然微卫星位点核心序列的重复次数在个体间呈高度变异性，但是其两端侧翼序列多是保守的单拷贝序列，因此可以用两端的侧翼序列设计成对引物，通过PCR技术，经聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）或其他适宜方式显示这些分子标记在不同个体间的多态性。微卫星分子标记具有以下特点：广泛分布于真核生物的基因组中；多态性信息容量高；呈共显性；遵循孟德尔遗传法则、中性选择等。基于以上特点，微卫星分子标记被广泛用于遗传多样性分析、植物遗传图谱的构建、基因定位、品种鉴定、种质保存、数量性状基因的分析、进化与亲缘关系等方面的研究。肉果草（Lanceatibetica），藏名巴丫巴，隶属于玄参科肉果草属，分布于青藏高原及其毗邻山区（西藏、青海、甘肃、四川、云南及印属喜马拉雅地区等），生于海拔2000-4500米的草地、疏林中或沟谷旁。肉果草为重要的藏药植物，全草有养肺排脓、清热止咳功效，花、果能治疗心脏病、血性肿瘤（血癌）、哮喘、痛肿疮疡等。肉果草药理作用主要有如下几个方面：（1）有抗肿瘤作用；（2）有抗氧化作用；（3）有抗疟作用；（4）有抗真菌作用；（5）有杀菌作用；（6）具有降糖的作用；（7）具有保肝作用。由于其具有很重要的药用价值，肉果草已经吸引了很多国内外学者的关注。在与玉树等地的藏医交流中发现，肉果草作为一味十分重要的藏药材，有着较为广泛的应用。但由于对该物种的遗传背景等研究较少，难以开展人工种植，仅依靠野外采挖获取，加剧了该物种的濒危进程。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术尚未开发肉果草微卫星标记的现状，利用限制性酶切位点相关DNA的简化基因组测序（RAD-seq）技术开发出肉果草微卫星分子标记并获得对应的引物，建立一种制备肉果草微卫星分子标记的方法，并由此可以进一步用这些分子标记进行遗传多样性分析、植物遗传图谱的构建、基因定位、品种鉴定、种质保存、数量性状基因的分析、进化与亲缘关系研究等。为了实现上述目的，本专利技术的技术方案为：一种肉果草微卫星分子标记，具有序列表SEQ.ID.No.1至SEQ.ID.No.10中任一种或多种的核苷酸序列,这些分子标记所对应的位点分别编号为LT4、LT7、LT9、LT10、LT12、LT15、LT16、LT18、LT25、LT28。适于本专利技术中任意一种或多种肉果草微卫星分子标记的特异性引物，具有序列表SEQIDNO.11至SEQIDNO.30中任一种或多种的核苷酸序列，各引物的特点及与微卫星分子标记（位点）的对应关系见表1。表1微卫星片段引物的特点及与微卫星分子标记（位点）的对应关系一种基于RAD-seq技术获取本专利技术所述肉果草微卫星分子标记的方法，其包括以下步骤：（1）肉果草DNA文库的构建：用CTAB法提取肉果草基因组DNA、通过限制性内切酶进行酶切、连接接头p1、随机打断、末端修复、加A尾、连接接头p2、PCR扩增、回收300-700bp序列和纯化，在IlluminaHiSeq测序平台上进行双末端测序；（2）测序数据质量控制：每端测序125bp，用IlluminaCasava1.8进行碱基识别(BaseCalling)，获得原始测序序列（SequencedReads）,称之为rawbase，对其测序质量分布、测序错误率分布以及GC含量分布进行检查,得到cleanbase；（3）RAD-Tag捕获率统计：统计cleanbase去重后reads中酶Tag开头的reads数，以及酶捕获的reads数目与去重后reads数目的比值，得到RAD-Tag相关统计信息（本专利技术RAD-Tag捕获率为97.65%，所有样本的数据量足够，测序质量合格，GC含量正常）；（4）聚类与组装：对于样本中含有酶识别位点reads，用cd-hit-est软件进行聚类，并从中选取reads支持数为10-400之间的类，根据聚类结果，用Velvetopt进行参数设置，对筛选后的类进行组装，组装后，并对125bp以下的contig进行过滤；（5）SSR检测：对于已经组装好的contig，用rimmomaticv.0.32软件进行SSR检测，SSR检测标准如下：SSR重复单元的最小长度为2bp、SSR重复单元的最大长度为6bp、SSR序列的最小长度为12bp、SSR上下游序列长度为100bp、两个SSR的最小距离为12bp；（6）分离SSR引物：用Primer3软件批量设计SSR引物，合成SSR引物，并鉴定其在不同肉果草中的多态性。一种利用本专利技术所述引物分析肉果草遗传多样性的方法，包括以下步骤：（1）实验材料的准备：肉果草采样，采集野外自然状态下肉果草生长正常的嫩叶，用硅胶迅速干燥后带回实验室，并分别提取用于检测分析的每个个体的基因组DNA；（2）PCR扩增：利用本专利技术所述的任意一对或多对引物，以提取的不同个体的基因组DNA为模板进行PCR扩增反应，94℃预变性4分钟，94℃变性45秒，退火30秒（退火温度见表1），72℃延伸35秒，变性至退火三个步骤重复35次，最后72℃充分延伸8分钟，4℃保存；（3）电泳检测：对PCR扩增产物进行1%的琼脂糖凝胶电泳检测，对于条带清晰的PCR产物用聚丙烯酰氨凝胶电泳进行检测；（4）结果分析：用genepop软件计算期望杂合度和观察杂合度，并计算近交系数，以此来描述相关肉果草微卫星DNA多态性的特征。本专利技术的有益效果：开发出肉果草微卫星分子标记并分离出对应的引物，并建立了行之有效的获取肉果草微卫星分子标记的方法，这些分子标记及其引物可进行遗传多样性分析、植物遗传图谱的构建、基因定位、品种鉴定、种质保存、数量性状基因的分析、进化与亲缘关系研究等。根据实际需要，可以采用本专利技术公开的任意一种或多种标记，或与相关标记对应的任意一对或多对特异性引物进行分析研究。附图说明图1是肉果草的DNA文库构建及库检示意图；图2是测序质量分布检测；图3是测序错误率分布检测；图4是G、C含量分布检测；图5是肉果草SSR不同重复单元数量统计；图6是LT4位点对所有个体扩增后经PAGE电泳检测图。具体实施方式为了详细说明本专利技术肉果草微卫星分子标记的
技术实现思路
、构造特征，以下结合实施方式并配合附图作进一步说明。实施例一：肉果草微卫星分子标记的制备方法1.肉果草DNA文库的构建1.1基因组DNA的提取：用CTAB法提取肉果草基因组，然后通过限制性内切酶进行酶切，酶切后的DNA片段连接接头p1。1.2混池：打断的DNA，经过末端修复后，在打断的DNA另一端加上A尾，然本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种肉果草微卫星分子标记，其特征在于具有序列表SEQ.ID.No.1至SEQ.ID.No.10中任意一种或多种的核苷酸序列。

【技术特征摘要】
1.一种肉果草微卫星分子标记，其特征在于具有序列表SEQ.ID.No.1至SEQ.ID.No.10中任意一种或多种的核苷酸序列。
2.一种适于权利要求1所述分子标记的特异性引物，其特征在于具有序列表SEQIDNO.11至SEQIDNO.30中任意一种或多种的核苷酸序列。
3.一种基于RAD-seq技术获取权利要求1所述的肉果草微卫星分子标记的方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）肉果草DNA文库的构建：用CTAB法提取肉果草基因组DNA、通过限制性内切酶进行酶切、连接接头p1、随机打断、末端修复、加A尾、连接接头p2、PCR扩增、回收300-700bp序列和纯化，在IlluminaHiSeq测序平台上进行双末端测序；
（2）测序数据质量控制：每端测序125bp，用IlluminaCasava1.8进行碱基识别，获得原始测序序列rawbase，对其测序质量分布、测序错误率分布以及GC含量分布进行检查，得到cleanbase；
（3）RAD-Tag捕获率统计：统计cleanbase去重后reads中酶Tag开头的reads数，以及酶捕获的reads数目与去重后reads数目的比值，得到RAD-Tag相关统计信息；
（4）聚类与组装：对于样本中的含有酶识别位点reads，用cd-hit-est软件进行聚类，并从中选取reads支持数为10-400之间的类，根据聚类结果，用Velvetopt进行参数设置，对筛选后的类进行组装，组装后，对125bp以下的contig进行过滤；<...

【专利技术属性】
技术研发人员：张发起，田尊哲，陈世龙，高庆波，
申请(专利权)人：中国科学院西北高原生物研究所，
类型：发明
国别省市：青海;63