华支睾吸虫液滴式数字PCR检测试剂盒及应用制造技术

本发明专利技术公开了一种华支睾吸虫液滴式数字PCR检测试剂盒，该试剂盒包括根据华支睾吸虫细胞色素C氧化酶亚单位1基因COI基因设计的特异性引物及荧光探针。此外，本发明专利技术还公开了用于检测华支睾吸虫的引物和探针以及所述的引物和探针在制备感染华支睾吸虫疾病诊断产品中的应用。所述引物的上游引物为如SEQ ID NO.1所示序列；下游引物为如SEQ ID NO.2所示序列；所述探针为如SEQ ID NO.3所示序列。本发明专利技术成功建立了一种可高效检测、华支睾吸虫粪便DNA的高灵敏的检测试剂盒，快速、敏感和特异，可用于华支睾吸虫感染，尤其是轻度感染的检测。

Detection kit of Clonorchis sinensis by drop type digital PCR and its application

【技术实现步骤摘要】
华支睾吸虫液滴式数字PCR检测试剂盒及应用
本专利技术涉及生物
，具体涉及一种PCR检测试剂盒，尤其涉及一种华支睾吸虫液滴式数字PCR检测试剂盒。此外，本专利技术涉及华支睾吸虫液滴式数字PCR检测试剂盒的应用。
技术介绍
华支睾吸虫是一种重要的食源性疾病，最新调查显示，我国约有598万感染者，珠江三角洲城镇与城郊生态区、东北平原西部生态区及三江平原生态区的华支睾吸虫病呈高度流行状态，感染率分别为23.36%、9.44%和8.53%。食鱼生的饮食习惯是致流行区人群华支睾吸虫感染的主要危险因素。华支睾吸虫病可致275370个伤残调整寿命年的损失，造成严重的经济负担。急性、严重感染会出现非特异性消化系统相关临床症状，如腹痛、腹泻、黄疸、胆囊炎、胆道纤维化、胆道结石等，慢性反复性感染会致肝胆管癌，2009年华支睾吸虫被国际癌症肿瘤机构列入Ι类致癌物。目前华支睾吸虫的检测主要仍然依靠粪便镜检（改良加藤厚涂片法），该方法被认为是确诊华支睾吸虫感染依据的金标准，但其灵敏度不高，易出现漏诊、错诊，且需依赖检测人员的经验和镜检能力。近年来，随着分子生物学技术的发展，各种核酸检测方法用于华支睾吸虫感染的检测，如环介导等温扩增技术（Loop-mediatedisothermalamplification，LAMP）、ELISA、PCR及实时荧光定量PCR，但这些检测方法受到样本核酸纯度、核酸抑制物或者抗体浓度等因素的影响而影响检测效率。中国专利技术专利CN201410676271公开了华支睾吸虫实时荧光PCR检测试剂盒及检测方法。而荧光定量PCR方法依赖标准品和标准曲线实现样本定量检测，但目前尚无法实现绝对定量。ddPCR（液滴式数字PCR，DropletdigitalPCR）是近几年发展起来的一种全新的核酸检测方法，其首先通过将微量DNA样本进行大量稀释，利用微流控技术产生大量的独立油包水乳化反应微滴，每个微滴不含有或含有一个至数个模板分子，通过PCR反应扩增，之后通过对每个微滴的荧光信号进行统计分析，根据泊松分布原理及阳性微滴的个数与比例定量DNA拷贝数。ddPCR方法不需要依赖标准品和标准曲线即可实现样本的绝对定量，且不易受到DNA样本中所含核酸抑制物或抗体浓度等因素的影响而影响检测效率。该方法在一定程度上弥补了以往PCR检测方法的不足，可实现低浓度核酸样本的高度灵敏和准确的绝对定量，检测敏感性更高。但是并非所有的基因对象检测都适用于ddPCR方法。目前尚未发现有采用ddPCR方法对华支睾吸虫检测的相关报道。本研究拟建立基于华支睾吸虫COI基因的ddPCR检测试剂盒，为华支睾吸虫病的早期、快速诊断等提供技术储备，也为该病的防控提供技术支持。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题之一在于提供一种华支睾吸虫液滴式数字PCR检测试剂盒。本专利技术以华支睾吸虫为研究对象，开发了一种快速，敏感，特异，高灵敏度的检测试剂盒。本专利技术要解决的技术问题之二在于提供用于检测华支睾吸虫的引物和探针及其用途。为解决上述技术问题，本专利技术是通过以下技术方案实现的：在本专利技术的一方面，提供一种华支睾吸虫液滴式数字PCR检测试剂盒，该试剂盒包括根据华支睾吸虫细胞色素C氧化酶亚单位1基因COI基因设计的特异性引物及荧光探针。作为本专利技术优选的技术方案，所述特异性引物及荧光探针的序列如下：其上游引物为如SEQIDNO.1所示序列；其下游引物为如SEQIDNO.2所示序列；所述荧光探针为如SEQIDNO.3所示序列；所述荧光探针的5’端和3’端分别连接有荧光报告基团和荧光淬灭基团；荧光报告基团包括：FAM、VIC、HEX、CY5和ROX，优选为FAM；荧光淬灭基团包括：MGB、BHQ1、Eclipse和TAMRA，优选为BHQ1。作为本专利技术优选的技术方案，该试剂盒包括以下液滴式数字PCR反应体系：2×ddPCR预混液（ddPCRTMSupermixforProbes（nodUTP））10µl，DNA模板1µl，10µmol如权利要求1所述的上游引物和下游引物各1µl，10µmol如权利要求1-3任一项所述的探针0.5µl，无菌水6.5µl，共20µl。作为本专利技术优选的技术方案，所述液滴式数字PCR的退火温度为53℃~60℃，最佳退火温度为56℃。作为本专利技术优选的技术方案，所述液滴式数字PCR的扩增反应条件如下：作为本专利技术优选的技术方案，所述液滴式数字PCR的扩增反应条件中的升降温度梯度为2℃/s；反应总体积设为40µl。在本专利技术的另一方面，提供上述试剂盒在制备感染华支睾吸虫病诊断产品中的应用。与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：本专利技术根据华支睾吸虫细胞色素C氧化酶亚单位1基因（COI）设计特异性引物及荧光探针，开发了高灵敏度华支睾吸虫液滴式数字PCR（DropletdigitalPCR，ddPCR）检测试剂盒，并针对该检测试剂盒进行敏感性、特异性、定量检测线性范围及重复性等方面进行评价。同时，应用现场采集华支睾吸虫阳性和阴性样本，进行华支睾吸虫ddPCR检测方法应用评价。结果：本专利技术研发了华支睾吸虫ddPCR检测试剂盒。该检测试剂盒的LOB值为1copies/20µl，LOD值为3copies/20µl，具有较高的敏感性；与片形吸虫虫卵、次睾吸虫成虫、猪带绦虫成虫、卫氏并殖吸虫成虫、斯氏狸殖吸虫成虫、三平正并殖吸虫成虫、细粒棘球绦虫和多房棘球绦虫原头节以及蓝氏贾第鞭毛虫和隐孢子虫DNA均无交叉反应，具有较好的特异性；该检测试剂盒检测最佳线性范围在0.43copies/µl~1015copies/ulDNA浓度，R2=0.9974；其检测CV值小于14%，有较好的重复性。基于以上数据证明本研究所建立的ddPCR检测试剂盒可对华支睾吸虫进行绝对定量，具有较好的灵敏度和特异性。现场采集样本应用结果显示，27例阳性样本，均检测为阳性，检测率为100%，且3次重复中均能检出，拷贝数在1copies/µl~72.5copies/µl；ROC曲线下面积为0.968，具有统计学意义，该方法具有较好的诊断价值。结论：本研究成功建立了一种可高效检测华支睾吸虫粪便DNA的高灵敏的检测试剂盒，快速、敏感和特异，可用于华支睾吸虫感染，尤其是轻度感染的检测。附图说明图1是本专利技术实施例1中ddPCR退火温度的优化结果示意图，其中，A02代表60℃；B02代表59.6℃；C02代表58.8℃；D02代表57.5℃；E02代表55.8℃；F02代表54.4℃；G02代表53.5℃；H02代表53℃。图2是本专利技术实施例1中华支睾吸虫ddPCR特异性检测微滴信号图，其中，A06代表华支睾吸虫；C06代表次睾吸虫；E06代表片形吸虫；G06代表卫氏并殖吸虫；A07代表斯氏狸殖吸虫；C07代表三平正并殖吸虫；E07代表多房棘球绦虫；A08代表细粒棘球绦虫；C08代表猪带绦虫；E08代表贾第虫和隐孢子虫混合样本。图3是本专利技术实施例1中华支睾吸虫ddPCR检测方法拷贝数与上样量折本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种华支睾吸虫液滴式数字PCR检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括根据华支睾吸虫细胞色素C氧化酶亚单位1基因COI基因设计的特异性引物及荧光探针。/n

【技术特征摘要】
1.一种华支睾吸虫液滴式数字PCR检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括根据华支睾吸虫细胞色素C氧化酶亚单位1基因COI基因设计的特异性引物及荧光探针。


2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述特异性引物及荧光探针的序列如下：
其上游引物为如SEQIDNO.1所示序列；其下游引物为如SEQIDNO.2所示序列；
所述荧光探针为如SEQIDNO.3所示序列；所述荧光探针的5’端和3’端分别连接有荧光报告基团和荧光淬灭基团；荧光报告基团包括：FAM、VIC、HEX、CY5和ROX；荧光淬灭基团包括：MGB、BHQ1、Eclipse和TAMRA。


3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述荧光报告基团为FAM；所述荧光淬灭基团为BHQ1。


4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括以下液滴式数字PCR反应体系：2...

【专利技术属性】
技术研发人员：沈玉娟，徐梦，曹胜魁，张小凡，曹建平，
申请(专利权)人：中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所，
类型：发明
国别省市：上海;31