本发明专利技术公开了一种鉴别两种散白蚁的ISSR‑SCAR标记方法，属于分子标记技术及昆虫分类领域。本方法在ISSR‑PCR的基础上获得了1个可以区分黑胸散白蚁和黄胸散白蚁两个物种DNA的特异性片段，并成功将其转化成SCAR分子标记。验证试验表明，该SCAR标记能特异性扩增黑胸散白蚁，而不能扩增黄胸散白蚁。因此本发明专利技术的SCAR标记方法能够快速、准确地鉴定黑胸散白蚁，并对二者进行区分。本发明专利技术方法对这两类白蚁的鉴别和白蚁的分类都具有重要的意义。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种鉴别两种散白蚁的ISSR-SCAR标记方法，属于分子标记技术及昆虫分类领域。
技术介绍
白蚁是一种多形态、群居性而又有严格分工的昆虫。白蚁体软而小，呈白色、淡黄色赤褐色直至黑褐色，头前口式或下口式，能自由活动，触角念珠状，腹基粗壮，前后翅等长，在分类地位上，白蚁属于较低级的半变态昆虫。因其以木材或纤维素为食，所以白蚁被认为是一种危害极大的世界性害虫，俗称\无牙老虎\。它在无声无息中蛀蚀着房屋、家具、衣物、图书，以及破坏装饰一新的新居。据估算我国每年房屋因白蚁危害造成的损失就在几十亿元人民币以上。有鉴于此，1999年10月国家建设部发布了72号令，将房屋装饰装修纳入了白蚁防治的范围。可见国家对白蚁防治问题给予了高度重视。散白蚁为土木两栖性白蚁，国外将其列为地栖性白蚁，广泛分布于温带及亚热带地区。散白蚁群体中较易产生补充生殖蚁而形成补充生殖群体，通过迁巢活动和群体分裂活动使其危害和栖居分散，不构筑结构复杂的大型蚁巢集中生活，故称散白蚁。早期传统的形态分类法主要依靠白蚁的兵蚁或有翅成虫进行，为白蚁的分类鉴定奠定了一定的基础。但是在区分一些相似种、近缘种上难度较大，容易引起误判。同时，白蚁的形态学分类往往需要一定数量的个体，分类时个体数目太少则会影响结果的可靠性，或者有时提供的待鉴定样本中缺少兵蚁类群，这都给白蚁的分类带来了较大的困难。由于散白蚁个体很小，而且种与种之间形态差异较小，通过传统的鉴定方法形态学鉴定特征进行区分有一定难度，在市场内同名异物、同物异名现象相当普遍，所以需要开发能够快速准确鉴定散白蚁品种的方法。ISSR(Inter-SimpleSequenceRepeats)是一种新型多态性分子标记，利用ISSR标记建立品种的指纹图谱进行品种的鉴定。ISSR标记具有所需DNA模板少，多态性高、信息量丰富、成本低、操作简单等优点。SCAR(SequenceCharacterizedAmplifiedRregions)则是一种特定序列扩增标记，通常是由RAPD、SRAP、SSR标记转化而来，一般表现为扩增片断的有无，是一种显性标记，当扩增区域内部发生少数碱基的插入、缺失、重复等变异时，表现为共显性遗传的特点。虽然ISSR分子标记技术能够明显的鉴别出DNA的细微差异，较为准确的区分各样品，但是易受反应条件的影响，重复性和稳定性较差。因而，有必要将两种分子标记结合起来，开发能够快速准确鉴定散白蚁品种且重复性和稳定性好的方法。
技术实现思路
为了解决上述问题，本专利技术将ISSR标记成功转化成序列特异扩增区域SCAR标记，为SCAR分子标记推广应用于散白蚁的快速准确鉴定提供技术依据。本专利技术的目的是提供一种能够鉴别黑胸和黄胸两种白蚁的ISSR-SCAR标记及其鉴定方法，通过筛选能够在两种散白蚁中扩增出特异性条带的ISSR引物，并针对特异性条带设计序列特异性引物，最终将黑胸散白蚁(Reticulitermeschinensis，RC)与黄胸散白蚁(Reticulitermesflaviceps，RF)区分开来，实现对这两种白蚁的特异性鉴定，为白蚁的分类及鉴定提供有力的技术支持。本专利技术的第一个目的是提供一种能够在两种散白蚁中扩增出特异性条带的ISSR引物，所述引物的核苷酸序列为CAA(GA)5，如SEQIDNO.1所示。所述散白蚁为黑胸散白蚁和黄胸散白蚁。本专利技术的第二个目的是提供一种能够鉴别两种散白蚁的引物对，所述引物对的核苷酸序列为SEQIDNO.2和SEQIDNO.3所示，即AGGCACAATGTAAATGGCTT和ACATGTTCTTTCCTGCGTTA。本专利技术的第三个目的是提供一种所述引物对的筛选方法，所述方法包括如下步骤：(1)设计ISSR引物对黑胸散白蚁和黄胸散白蚁进行PCR扩增，筛选能够在某一种白蚁(黑胸散白蚁或黄胸散白蚁)中能扩增得到特异性条带的引物；(2)将在某一白蚁(黑胸散白蚁)样本扩增后得到的特异性条带切胶回收并测序；(3)根据步骤(2)中的测序序列设计序列特异性SCAR引物；(4)使用步骤(3)所设计出来的SCAR引物在两种白蚁基因组DNA中进行PCR验证；(5)根据步骤(4)的验证结果，挑选能够特异性扩增黑胸散白蚁DNA而无法特异性扩增黄胸散白蚁DNA的引物。在本专利技术的一种实施方式中，所述步骤(1)中，PCR扩增的反应体系为：灭菌去离子水16.1μl，10×PCRbuffer(含Mg2+)2.0μl，dNTPs(10mM)0.4μl，P1(10μM)1.0μl，rTaqDNApolymerase(2U/μl)0.5μl，模板(20ng/μl)1.0μl。在本专利技术的一种实施方式中，所述步骤(1)中，PCR扩增的反应程序为：94℃5min，(94℃45s，Tm℃45s，72℃1.5min)×35个循环，72℃10min，4℃保温。本专利技术的第四个目的是提供一种所述引物鉴别黑胸散白蚁和黄胸散白蚁的应用，所述应用，是利用所述引物对待鉴定样品进行PCR扩增，如果得到420-500bp(456bp)大小的片段，那么待鉴定样品为黑胸散白蚁，否则为其他白蚁种类。在本专利技术的一种实施方式中，所述应用，是先提取待鉴定样品的基因组DNA，再进行PCR扩增。在本专利技术的一种实施方式中，所述待鉴定样品的基因组DNA，以散白蚁头部作为材料进行提取，以避免散白蚁肠道共生微生物的污染。在本专利技术的一种实施方式中，所述应用中PCR扩增的反应体系为：反应体积20μl，包括1.5μlDNA模板(20ng/μl)，2.4μlMg2+(25mM)，0.4μldNTPs(10mM)，0.8μl引物(10μM)，2.0μl10×PCRbuffer，0.5μlrTaqDNApolymerase(5U/μl)，12.4μl灭菌去离子水。在本专利技术的一种实施方式中，所述应用中PCR扩增的反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性45s，在各自退火温度下退火45s，72℃延伸，延伸时间按1min延伸1000bp计算，反应34个循环；然后72℃延伸10min，4℃保温。在本专利技术的一种实施方式中，所述待鉴定样品为黑胸散白蚁或黄胸散白蚁。本专利技术的有益效果：(1)本专利技术提供了一种可以快速、准确地鉴别黑胸散白蚁与黄胸散白蚁的特异性分子标记及方法，对于这两种白蚁分子水平上的鉴定与相关昆虫分类学具有重要的意义。(2)本专利技术的引物对重复性好、稳定性好。具体实施方案下述实施例中所用方法如无特别说明，均为常规方法。引物均由上海生工生物工程有限公司合成；DNA胶回收试剂盒和非感受态细胞试剂盒购自上海生工生物工程有限公司；Taq酶和Trans2KDNAMarker购自北京全式金公司；PCR扩增仪(TpersonalThermocycler，Biometra)为德国产品；MiniBisPro型凝胶成像分析系统为以色列DNR凝胶成像系统有限公司的产品；离心机为德国Hettich微量常温冷冻离心机(MIKRO220、220R)；DYY—6C型电泳装置购自北京市六一仪器厂；暗箱式紫外分析仪(YLN—III)为北京麦思奇高科技有限公司产品。下面对本专利技术的实施例进行详细说明。实施例1：两种散白蚁的基因组DNA提取实验用两种散白蚁分别为采自安徽省蚌埠市南山区的本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种能够鉴别两种散白蚁的引物对，所述引物对的核苷酸序列为SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。
【技术特征摘要】
1.一种能够鉴别两种散白蚁的引物对，所述引物对的核苷酸序列为SEQIDNO.2和SEQIDNO.3所示。2.根据权利要求1所述的引物对，其特征在于，所述散白蚁为黑胸散白蚁和黄胸散白蚁。3.权利要求1所述引物对在散白蚁鉴定方面的应用。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述应用是利用所述引物对待鉴定样品进行PCR扩增，如果得到420-500bp大小的片段，那么待鉴定样品为黑胸散白蚁，否则为其他白蚁种类。5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述待鉴定样品的基因组DNA，以散白蚁头部作为材料进行提取，以避免散白蚁肠道共生微生物的污染。6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述应用，是先提取待鉴定样品的基因组DNA，再进行PCR扩增。7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述应用中PCR扩增的反应体系为：反应体积20μl，包括1.5μlDNA模板(20ng/μl)，2.4μlMg2+(25mM)，0.4μldNTPs(10mM)，0.8μl引物(10μM)，2.0μl10×PCRbuffer，0.5μlr...
【专利技术属性】
技术研发人员：龙雁华，何宏竹，欧阳基，庞正平，王众，杨云秋，
申请(专利权)人：安徽农业大学，
类型：发明
国别省市：安徽;34
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