芸薹属栽培种细胞质的分子检测方法技术

本发明专利技术公开了芸薹属几个栽培种细胞质的分子检测方法，用其线粒体和叶绿体目标基因的特异性引物进行PCR扩增，将PCR的电泳检测结果进行数字化处理，用遗传分析软件进行分析，根据植物材料间的遗传距离聚类结果，区分来自不同栽培种的细胞质；本发明专利技术能快速、有效地鉴别芸薹属栽培种细胞质，为品种选育和材料创新提供帮助。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，具体涉及。
技术介绍
芸薹属栽培种包括白菜（汉ra/?a;AA，2n=20)、甘蓝（汉o/eraceACC，2n= 18)和黑芥（汉2n = 16) 3个二倍体基本种以及甘蓝型油菜U z^^AACC， 2n=38)、芥菜型油菜（汉 j'w/7c<9a;AABB, 2n=36)和埃塞俄比亚芥（汉 cari/?ate;BBCC， 2n = 34) 3个四倍体复合种。 远缘杂交是同种间属间甚至亲缘关系更远的物种之间的杂交，可以把不同种、属 的特征、特性结合起来，从而突破种属界限，扩大遗传变异，从而创造新的变异类型或新物 种。 甘蓝型油菜是芸薹属中的重要作物之一，在世界范围内均有较大的种植面积。甘 蓝型油菜为异源双二倍体。由基本种白菜型油菜和甘蓝在自然界通过种间杂交后双二倍 化进化而来。随着育种工作的不断深入，甘蓝型油菜种内可利用的基因资源日趋贫乏。可 以有意识地利用属间甚至亲缘关系更远的物种进行杂交，能有效拓展甘蓝型油菜的遗传变 异，充分利用远缘物种的高度抗病性和对环境胁迫的抵抗能力，来改良栽培品种。 植物细胞质有自己的遗传系统，它的DNA分布于线粒体和叶绿体中，细胞质DNA 能通过自己的转录翻译系统来指导部分细胞质生物大分子的合成，如卡尔文循环中的关键 酶--核酮糖羧化酶(加氧酶）的大亚基、线粒体中细胞色素氧化酶蛋白。植物细胞质具有 尚度异质性，由细胞质遗传系统决定，不受细胞核基因及环境因素的影响。 目前，针对芸薹属不同栽培种之间细胞质的鉴别方法研宄较少，而针对甘蓝型油 菜中几种常见的细胞质类型：Nap细胞质类型（Nap)、玻里玛系统细胞质（Pol)、陕2A细 胞质（2A)、Cam细胞质类型、萝卜质细胞质类型（Ogu)等的鉴别较多。通常采用普通遗传 学方法、线粒体基因组DNA的限制性片段长度多态性（mtDNA-RFLP)(杨光圣等，中国农业 科学，2009, 31 (1) :27-31)、PCR 技术(程计华等，作物学报，2008, 34(11) :1946-1952 ;张瑞 杰等，西北农业学报，2012,21(10) :59-64)。普通遗传学鉴定费时费力，需要2~3年， mtDNA-RFLP方法实验周期缩短到几天时间，但线粒体DNA的限制性酶切和酶切片段的分离 检测操作难度大且成本高，应用PCR技术检测是现今最为简洁方便的方法。 目前，芸薹属栽培种的线粒体和叶绿体全基因组已被测序，可以根据这些特异基 因组序列开发分子标记，利用PCR技术快速鉴别不同栽培种的细胞质类型，由此将极大地 提高工作效率。
技术实现思路
本专利技术的目的是解决目前缺乏芸薹属栽培种细胞质分子鉴定方法的问题，提供芸 薹属几个栽培种细胞质的分子检测方法。 本专利技术采用的是PCR技术，是针对芸薹属栽培种细胞质目标基因特定位点设计特 异引物，进行PCR扩增，检测得到的DNA多态性，以此做为分子标记的技术。 本专利技术提供的芸薹属几个栽培种细胞质的分子检测方法，具体步骤如下：用线粒 体和叶绿体目标基因的特异性引物进行PCR反应，以芸薹属几个栽培种：包括白菜、甘蓝、 黑芥、甘蓝型油菜、芥菜型油菜和埃塞俄比亚芥的线粒体和叶绿体DNA为模板，用以下13对 特异号\物对ccmp2、trnL-F、rpll6、trnE-trnT、ACP2、ACP4、ACP35、ACP38、ACP47、ACP29、 Bn 77?7、Bn 77P4进行扩增，其中： 第一对引物序列为： 正向引物 5' -GATCCCGGACGTAATCCTG-3' 反向引物 5' -ATCGTACCGAGGGITCGAAT-3' 第二对引物序列为： 正向引物 5' -TCAATTGCACAITCTAGAAITCTAAG-3' 反向引物 5' -CAAITCAATATGGTTATATATTAGAG-3' 第三对引物序列为： 正向引物 5' -GGTTCCGTCGITCCCATCGC-3' 反向引物 5' -CATAATAATTAGATAAATCTGITCC-3' 第四对引物序列为： 正向引物 5' -AATGGTATGACTAGCTTATAAGG-3' 反向引物 5' -CTTAACAATGAGATGAGGCAATC-3' 第五对引物序列为： 正向引物 5' -GAAAAATGCAAGCACGGITT-3' 反向引物 5' -TACGATCCGTAGTGGGITGC-3' 第六对引物序列为： 正向引物 5' -TACCCGTATTAGGCACTA-3' 反向引物 5' -ITTGTAAGACCACGACTG-3' 第七对引物序列为： 正向引物 5' -AITGGCTTACTTCTTGCG-3' 反向引物 5' -GGITTCCGGGATGTTAIT-3' 第八对引物序列为： 正向引物 5' -GGirCGTTAGCAGGITTA-3' 反向引物 5' -GITCCCTAGCAACACm-3' 第九对引物序列为： 正向引物 5' -TGTACTTATGGGAAAGCG-3' 反向引物 5' -CTGGGITCTTCTACTTCAIT-3' 第十对引物序列为： 正向引物 5' -GGCCATAGGCTGGAAAGTCT-3' 反向引物 5' -GITTATGCATGGCGAAAAGG-3' 第十一对引物序列为： 正向引物 5' -CCAAAAACTTGGAGATCCAACTAC-3' 反向引物 5' -TTCCATAGAITCGATCGTGGITTA-3' 第十二对引物序列为： 正向引物 5' -CCGTTAGGGGTAITTAGTAACTCG-3' 反向引物 5' -ACATAATGGCAATGTATCGGACTG-3' 第十三对引物序列为： 正向引物 5' -GAAGTCCGAGGACCTTTAGTACC-3' 反向引物 5' -AGTAAGTTGTAGGTAGGGGCTTCAT-3' 其中，所述PCR的反应体系如下： PCR反应体系为10ML，包含20ng模板，正向引物和反向引物引物各0. 25ymol/L，lx Taq buffer,MgCl2 1. 5 mmol/L,每种 dNTP 0? 2 mmol/L，0? 5 U 的 DNA 聚合酶，然后用 ddH20 补足 10ul。采用 Touch down 扩增程序：94°C 预变性 3min;94°C 变性 30s，60°C 退火30s，72°C延伸45s，10个循环，每个循环退火温度降低0. 5°C ;94°C变性lmin，57°C退 火30s，72°C延伸45s，28个循环；72°C延伸lOmin;通过PCR扩增，分别获得100-400bp的 片段。 将PCR的电泳检测结果进行数字化处理，用遗传分析软件进行分析，根据植物材 料间的遗传距离聚类结果，区分来自不同栽培种的细胞质。 本专利技术得到的有益效果:本专利技术采用PCR分子标记技术对芸薹属栽培种细胞质进 行分子水平的多态性检测，本专利技术的方法非常适用于对含芸薹属栽培种细胞质的材料进行 鉴定，具有以下优点： (1)本专利技术鉴定引物和鉴定方法具有快速准确、稳定可靠的特点。 (2)可进彳丁尚通量筛选，提尚了鉴定效率。【附图说明】图1为本专利技术中显示第十本文档来自技高网...

【技术保护点】
芸薹属栽培种细胞质的分子检测方法，其特征在于：对其线粒体和叶绿体DNA为模板，用以下13对特异引物对ccmp2、trnL‑F、rpl16、trnE‑trnT、ACP2、ACP4、ACP35、ACP38、ACP47、ACP29、PsbB‑PsbT、BnTR1、BnTR4进行扩增，其中：第一对引物序列为：正向引物 5’ ‑GATCCCGGACGTAATCCTG‑3’反向引物 5’ ‑ATCGTACCGAGGGTTCGAAT‑3’第二对引物序列为：正向引物 5’ ‑TCAATTGCACATTCTAGAATTCTAAG‑3’反向引物 5’ ‑CAATTCAATATGGTTATATATTAGAG‑3’第三对引物序列为：正向引物 5’ ‑GGTTCCGTCGTTCCCATCGC‑3’反向引物 5’ ‑CATAATAATTAGATAAATCTGTTCC‑3’第四对引物序列为：正向引物 5’ ‑AATGGTATGACTAGCTTATAAGG‑3’反向引物 5’ ‑CTTAACAATGAGATGAGGCAATC‑3’第五对引物序列为：正向引物 5’ ‑GAAAAATGCAAGCACGGTTT‑3’反向引物 5’ ‑TACGATCCGTAGTGGGTTGC‑3’第六对引物序列为：正向引物 5’ ‑TACCCGTATTAGGCACTA‑3’反向引物 5’ ‑TTTGTAAGACCACGACTG‑3’第七对引物序列为：正向引物 5’ ‑ATTGGCTTACTTCTTGCG‑3’反向引物 5’ ‑GGTTTCCGGGATGTTATT‑3’第八对引物序列为：正向引物 5’ ‑GGTTCGTTAGCAGGTTTA‑3’反向引物 5’ ‑GTTCCCTAGCAACACTTT‑3’第九对引物序列为：正向引物 5’ ‑TGTACTTATGGGAAAGCG‑3’反向引物 5’ ‑CTGGGTTCTTCTACTTCATT‑3’第十对引物序列为：正向引物 5’ ‑GGCCATAGGCTGGAAAGTCT‑3’反向引物 5’ ‑GTTTATGCATGGCGAAAAGG‑3’第十一对引物序列为：正向引物 5’ ‑CCAAAAACTTGGAGATCCAACTAC‑3’反向引物 5’ ‑TTCCATAGATTCGATCGTGGTTTA‑3’第十二对引物序列为：正向引物 5’ ‑CCGTTAGGGGTATTTAGTAACTCG‑3’反向引物 5’ ‑ACATAATGGCAATGTATCGGACTG‑3’第十三对引物序列为：正向引物 5’ ‑GAAGTCCGAGGACCTTTAGTACC‑3’反向引物 5’ ‑AGTAAGTTGTAGGTAGGGGCTTCAT‑3’。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：向阳，杜才富，张敏琴，张星星，王大红，韩宏仕，李大雄，张涛，
申请(专利权)人：贵州禾睦福种子有限公司，贵州省油菜研究所，
类型：发明
国别省市：贵州;52