本发明专利技术公开了一种快速检测柑橘半穿刺线虫的环等温扩增引物及其应用。所述引物包括引物对TSF3/TSB3和引物对TSFIP/TSBIP，引物的序列分别如SEQ ID NO.1～4所示。本发明专利技术以该引物建立了环等温扩增方法，以样品DNA为模板进行环等温扩增，反应结束后可通过两种方式判断结果：一是扩增产物进行电泳，出现特异阶梯状条带的样品判定为阳性；二是通过向反应体系中加入SYBR green I，通过肉眼观察出现颜色变化的样品为阳性。该环等温扩增方法对仪器设备要求低、快速、安全、特异性好、敏感性强，为柑橘半穿刺线虫的检测，尤其是基层检疫单位对柑橘半穿刺线虫的快速检测工作提供了技术支持，具有很好的推广应用价值。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于植物病原检测
更具体地，涉及一种快速检测柑橘半穿刺线虫的环等温扩增引物及其应用。
技术介绍
在柑橘根围有多种的植物寄生线虫，但只有少数的几种能对柑橘的产量造成影响，其中柑橘半穿刺线虫危害最严重的一种线虫，每年造成10～30%柑橘产量的损失。柑橘半穿刺线虫（Tylenchulus semipenetrans）分布广泛，目前在世界各个主要的柑橘种植区域都发现该种线虫。在美国，高达60～90%的柑橘园受到这种线虫的危害。在国内，这种线虫危害也非常普遍，如在四川省的柑橘园柑橘半穿刺线虫的发病率达到87.14%，在云南省发病率甚至达到100%。柑橘半穿刺线虫危害后会引起柑橘的“慢性衰退病”。这种病的诊断非常困难，因为该病的症状主要是黄化、萎蔫、植株生长缓慢、叶片较小和较少、果实较小和产量下降，这些症状与由于缺水或缺乏营养导致的症状类似。目前，准确的诊断该病的唯一方法就是鉴定土壤中是否存在柑橘半穿刺线虫。这就需要进行土壤采样，然后鉴定线虫种类和测量柑橘半穿刺线虫的数量。然而，目前还主要是通过形态学鉴定半穿刺线虫，但是形态学鉴定需要认真的观察线虫的形态和测量线虫线虫不同结构的大小，这要求鉴定的人员有多年的线虫鉴定经验，专业要求很高。刘国坤首先开发出一种通过PCR方法鉴定柑橘半穿刺线虫的方法；但是，该方法需要使用昂贵的PCR仪，而且，还需要进行电泳检测，对操作人员的技术要求较高，同样不利于在基层检测单位中推广和使用。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是克服现有柑橘半穿刺线虫检测技术的不足，提供一种安全、简单、快速、特异性高、敏感性好的检测柑橘半穿刺线虫的等温PCR方法，该方法仅需要使用恒温水浴，而且可以通过裸眼观察直接判断样品中是否含有靶标的柑橘半穿刺线虫。本专利技术的目的是提供一种快速检测柑橘半穿刺线虫的环等温扩增引物。本专利技术另一目的是提供上述环等温扩增引物的应用。本专利技术上述目的通过以下技术方案实现：一种快速检测柑橘半穿刺线虫的环等温扩增引物，包括引物对TSF3/ TSB3和引物对TSFIP/ TSBIP；引物TSF3的序列如SEQ ID NO.1所示），引物TSB3的序列如SEQ ID NO.2所示，引物TSFIP的序列如SEQ ID NO.3所示，引物TSBIP的序列如SEQ ID NO.4所示。上述环等温扩增引物在检测柑橘半穿刺线虫方面的应用或者在制备检测柑橘半穿刺线虫的试剂或试剂盒方面的应用，也都应在本专利技术的保护范围之内。一种快速检测柑橘半穿刺线虫的环等温扩增方法，该方法是以样品DNA为模板，利用上述引物对TSF3/ TSB3和引物对TSFIP/ TSBIP进行环介导等温扩增反应。所述环介导等温扩增反应结果的判定方法为：将扩增产物进行凝胶电泳，如果出现特异性阶梯状条带，则判定样品中含有柑橘半穿刺线虫DNA，即为柑橘半穿刺线虫阳性；或者向扩增产物中加入SYBR green I或钙黄绿素，如果扩增产物由橘红色变为浅绿色，则判定样品中含有柑橘半穿刺线虫DNA，即为柑橘半穿刺线虫阳性。优选地，所述环等温扩增方法的反应体系为：1μL DNA，引物TSFIP和TSBIP各1.6μM，引物TSF3和TSB3各0.2μM，dNTP 0.35 μM，2.5μL 10×BST2.0 DNA聚合酶缓冲液，0.8M甜菜碱，1.5 μL MgSO4(100 mM)，1 μL BST2.0 DNA聚合酶，余量ddH2O补足，共25 μL。优选地，所述环等温扩增方法的反应条件为：65℃反应60min。一种快速检测柑橘半穿刺线虫的试剂盒，所述试剂盒包括上述引物对TSF3/ TSB3和引物对TSFIP/ TSBIP。所述试剂盒所使用的检测方法即为上述环等温扩增方法。上述环等温扩增方法或上述试剂盒在检测柑橘半穿刺线虫方面的应用也都在本专利技术的保护范围之内。本专利技术通过大量的研究和探索，最终得到的引物对TSF3/ TSB3和引物对TSFIP/ TSBIP配方使用，建立的环等温扩增方法，不仅能够非常特异的检测柑橘半穿刺线虫，而且检测灵敏性达到了单条，甚至是0.1条的灵敏度，检测效果非常好。而且环等温扩增方法不需要依赖于任何昂贵的仪器，对实验检测人员的要求也很低，是一种安全、简单、快速、成本低的检测方法。本专利技术具有以下有益效果：本专利技术提供了一组快速检测柑橘半穿刺线虫的环等温扩增引物。所述引物特异性强、灵敏度好、且具有很好的重复性。本专利技术利用所述引物进行环介导等温扩增反应检测柑橘半穿刺线虫，检测灵敏性达到了单条，甚至是0.1条的灵敏度。本专利技术仅需使用简单的恒温仪器就能完成全部的检测，不需要依赖于任何昂贵的仪器，并且检测时间仅为60min，比普通的RT-PCR提前了2～3h，简单快速、对环境要求低、无需大型仪器，非常适合在基层检测单位中使用。另外，本方法检测结果的判定方法多样，可根据实际情况进行选择。本方法还可以实现扩增反应结果的可视化，准确可靠，无需电泳检测，不使用溴化乙锭，保障了工作人员的安全，为柑橘半穿刺线虫的检测，尤其是检验检疫工作提供了技术支持，具有非常好的推广应用价值。附图说明图1为不同退火温度对扩增效率的影响。图2为反应时间与LAMP产物的量的关系；图中100、80、50、10、1和0.1表示使用的DNA来自于100、80、50、10、1和0.1条柑橘半穿刺线虫，CK表示使用灭菌水作为模板；图中Y轴为荧光强度，X轴为反应的循环数，每个循环为2min。图3为LAMP检测柑橘半穿刺线虫的电泳检测图；图中0.1、1、10和100表示使用的DNA来自于0.1、1、10和100条柑橘半穿刺线虫，CK表示使用灭菌水作为模板，M为DNA分子量marker。图4为LAMP检测柑橘半穿刺线虫的可视化检测效果图；图中0.1、1、10和100表示使用的DNA来自于0.1、1、10和100条柑橘半穿刺线虫，CK表示使用灭菌水作为模板。图5为LAMP检测柑橘半穿刺线虫的特异性；图中1～5为不同种群的柑橘半穿刺线虫，6～21为非靶标线虫（具体种类见表1），22为阴性对照。具体实施方式以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本专利技术，但实施例并不对本专利技术做任何形式的限定。除非特别说明，本专利技术采用的试剂、方法和设备为本
常规试剂、方法和设备。除非特别说明，本专利技术所用试剂和材料均为市购。本专利技术所述的“0.1条柑橘半穿刺线虫的DNA模板”是指用1条线虫提取的DNA稀释10倍后的DNA模板。其中用1条线虫提取DNA的方法采用Subbotin et al. (2008)所述方法进行。实施例1 引物的设计根据NCBI中柑橘半穿刺线虫的ITS DNA序列（基因登录号为：FJ969705、GU433381 JN112270、JN112269、GU433403、GU433405 ）设计引物，引物设计使用软件PRIMEREXPLORER v.4 software 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种快速检测柑橘半穿刺线虫的环等温扩增引物，其特征在于，包括引物对TSF3/ TSB3和引物对TSFIP/ TSBIP；引物TSF3的序列如SEQ ID NO.1所示，引物TSB3的序列如SEQ ID NO.2所示，引物TSFIP的序列如SEQ ID NO.3所示，引物TSBIP的序列如SEQ ID NO.4所示。
【技术特征摘要】
1.一种快速检测柑橘半穿刺线虫的环等温扩增引物，其特征在于，包括引物对TSF3/ TSB3和引物对TSFIP/ TSBIP；引物TSF3的序列如SEQ ID NO.1所示，引物TSB3的序列如SEQ ID NO.2所示，引物TSFIP的序列如SEQ ID NO.3所示，引物TSBIP的序列如SEQ ID NO.4所示。
2. 权利要求1所述环等温扩增引物在检测柑橘半穿刺线虫方面的应用。
3. 权利要求1所述环等温扩增引物在制备检测柑橘半穿刺线虫的试剂或试剂盒方面的应用。
4. 一种快速检测柑橘半穿刺线虫的环等温扩增方法，其特征在于，该方法是以样品DNA为模板，利用权利要求1所述引物对TSF3/ TSB3和引物对TSFIP/ TSBIP进行环介导等温扩增反应。
5. 根据权利要求4所述环等温扩增方法，其特征在于，所述环介导等温扩增反应结果的判定方法为：将扩增产物进行凝胶电泳，如果出现特异性阶梯状条带，则判定样品中含有柑橘半穿刺线虫DNA，即为柑橘半穿刺线虫阳性；
或者向扩增产物中加入SYBR green I或钙黄绿素，...
【专利技术属性】
技术研发人员：林柏荣，廖金铃，卓侃，王宏洪，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：广东;44
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