一种用于水稻细胞质鉴定的分子标记方法技术

本发明专利技术涉及水稻利用领域，具体而言，涉及一种用于水稻细胞质鉴定的分子标记方法。该方法包括：分析比对CW、Lead、Nipponbare和9311的线粒体基因组，筛选出不保守的MS序列；根据MS序列设计相应的分子标记PCR引物；提取不同品种的水稻的总DNA；以总DNA作为模板，以分子标记PCR引物作为引物进行PCR扩增，获得扩增产物；对扩增产物进行电泳检测，筛选出能够导致扩增差异的多态性引物，并获得利用该多态性引物扩增得到的目的条带；对利用所述多态性引物扩增获得的目标条带进行统计，建立聚类图，以进行亲缘关系分析。本发明专利技术提供的用于水稻细胞质鉴定的分子标记方法，操作简便，所需设备也简单，结果可靠稳定。

【技术实现步骤摘要】
一种用于水稻细胞质鉴定的分子标记方法
本专利技术涉及水稻利用领域，具体而言，涉及一种用于水稻细胞质鉴定的分子标记方法。
技术介绍
由于线粒体基因组的重组，导致植物线粒体基因组的序列具有很大的差异，比较分析任何两个植物物种(甚至是同源物种)的线粒体基因组的基因间区发现，大部分基因间区都不是保守的。因此，植物线粒体基因组存在各自特异的序列(Mitochondrial-specificsequences，简称MS)。例如，将小麦Ks3和Km3的线粒体基因组进行比较，只有85.2％的序列为保守序列，Ks3包含11.38％的Km3所没有的特异序列，与NCBI数据库比较，7.3％Ks3序列为新序列，其中大部分特异序列位于进化速率快的基因间区。再如，比较SugarbeetTK81-MS和TK81-O线粒体基因组，发现，TK81-MS存在68kbTK81-O没有的MS，类核、类叶绿体、类线粒体-episome的MSS分别占7.6％、17.9％、0.1％和4.6％，其余为未知来源。目前，水稻已测序完成了4个线粒体基因组，分别是水稻品种Nipponbare、9311、CW和LD。其中，Nipponbare是一个典型的粳稻品种，9311为典型的籼稻品种；CW细胞质来源于中国普通野生稻W1(Oryzarufipogon)；LD细胞质来源于籼稻品种缅甸的Lead水稻。水稻线粒体基因组最大的为CW(559,045bp)，而LD只有434,745bp，同线性分析表明，Nipponbare和9311较为保守，而CW和LD与其他两个已测序的水稻线粒体基因组在序列组成及排列上差异都很大，即水稻线粒体基因组也存在大量的特异序列(MS)。由于不同的水稻种的线粒体基因组存在较大的差异，因此，对于其亲缘关系以及进化分析可采用相应的细胞质分子鉴定的方法。在相关技术中，对水稻而言，一般采用RFLP分子标记研究其进化分析、亲缘关系；然而RFLP分子标记需要进行酶切、凝胶电泳、转膜以及放射性标记的探针杂交等一系列的操作，整个操作繁琐复杂、费时耗力。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种用于水稻细胞质鉴定的分子标记方法，以解决上述的问题。在本专利技术的实施例中提供了一种用于水稻细胞质鉴定的分子标记方法，包括以下步骤：分析比对CW、Lead、Nipponbare和9311的线粒体基因组，筛选出不保守的MS序列；根据所述MS序列设计相应的分子标记PCR引物；提取不同品种的水稻的总DNA；以所述总DNA作为模板，以所述分子标记PCR引物作为引物进行PCR扩增，获得扩增产物；对所述扩增产物进行电泳检测，筛选出能够导致扩增差异的多态性引物，并获得利用该多态性引物扩增得到的目的条带；对利用所述多态性引物扩增获得的目标条带进行统计，建立聚类图，以进行亲缘关系分析。本专利技术的实施例中提供的用于水稻细胞质鉴定的分子标记方法，其通过分析比对4个已知水稻的线粒体基因组序列，筛选出了不保守的MS序列(多个)，然后再根据所述MS序列设计相应的分子标记PCR引物，每个MS序列对应设置一对分子标记PCR引物。然后再以不同品种的水稻的总DNA为模板，以所述分子标记PCR引物作为引物进行PCR扩增，获得扩增产物；将扩增产物进行电泳检测，并筛选出能够导致扩增差异的多态性引物(对于每一种引物，如果一部分水稻种类能扩增出带，而另外一部分水稻种类不能扩增出带，则该引物为多态性引物)以及该多态性引物扩增得到的目的条带；再对利用所述多态性引物扩增获得的目标条带进行统计，建立聚类图，以进行亲缘关系分析，进而获得不同种类水稻的进化关系。与现有技术中常见的RFLP分子标记相比，本专利技术提供的这种用于水稻细胞质鉴定的分子标记方法，其操作简便，所需设备也简单，只需要PCR仪、台式离心机以及凝胶电泳设备以及相应的分析软件即可完成整个鉴定操作，常规的分子实验室可完成整个实验操作，因此，克服了现有技术中RFLP分子标记操作繁琐复杂、费时耗力的缺陷。另外，由于在水稻线粒体的MS位置区序列，其不易再发生线粒体基因组重组，因此，在本专利技术的实施例中，在利用所述MS序列设计相应的分子标记PCR引物以及后续一系列操作开发的本的分子标记，其结果可靠稳定。可选的，在所述提取不同品种的水稻的总DNA的步骤中：所述不同品种的水稻包括11种粳稻品种和12种籼稻品种。可选的，所述11种粳稻品种具体包括：合系41、农垦58、E5、02428、盐粳48、武育粳7号、日本晴、辽粳944、中花11、湘晴、千辛124；所述12种籼稻品种具体包括：南京6号、矮脚南特、特青、93-11、67468、78360、76354、78267、76343、珍汕97B、楚粳23A、70928。可选的，在所述分析比对CW、Lead、Nipponbare和9311的线粒体基因组，筛选出不保守的MS序列的步骤中，具体包括：使用BLAST2软件分析比对CW、Lead、Nipponbare和9311的线粒体基因组，筛选出55个不保守的MS序列。可选的，在所述提取不同品种的水稻的总DNA的步骤中，具体包括：取不同品种水稻幼苗2-3克，提取其总DNA。可选的，在所述以所述总DNA作为模板，以所述分子标记PCR引物作为引物进行PCR扩增；获得扩增产物的步骤中；所述PCR扩增的反应体系包括：50ng/μl总DNA0.8-1.2μl、10×PCRbuffer0.8-1.2μl、25mMMgCl20.6-0.9μl、25μMdNTP0.3-0.6μl、1U/μlTaq酶0.3-0.6μl、10pM的分子标记PCR引物0.8-1.2μl，去离子无菌水5.2-7.2μl。可选的，在所述以所述总DNA作为模板，以所述分子标记PCR引物作为引物进行PCR扩增；获得扩增产物的步骤中；所述PCR扩增的反应程序包括：94℃预变性5分钟、94℃变性1分钟、55℃退火1分钟、72℃延伸1分钟，循环30次。可选的，在所述对所述扩增产物进行电泳检测，筛选出能够导致扩增差异的多态性引物，并获得该多态性引物扩增得到的目的条带的步骤中：所述电泳检测具体为聚丙烯酰胺凝胶电泳。可选的，在所述对利用所述多态性引物扩增获得的目标条带进行统计，建立聚类图，以进行亲缘关系分析的步骤中，具体包括：对利用所述多态性引物扩增获得的目标条带进行统计，利用NumericalTaxonomyandMultivariateAnalysisSystemVersion1.60软件分析获得不同水稻之间的相似系数，利用平均距离法以及NTSYS程序运算建立聚类图，以进行不同水稻之间的亲缘关系分析。附图说明图1示出了本专利技术实施例一提供的用于水稻细胞质鉴定的分子标记方法的流程图；图2示出了本专利技术实施例二中多态性引物M12对23种水稻的PCR扩增产物的电泳图；图3示出了本专利技术实施例二中多态性引物M12分别对15株si8和sj1的PCR扩增电泳图；图4示出了本专利技术实施例二中24对多态性引物23个水稻品种的UPGMA法聚类图。具体实施方式下面通过具体的实施例子并结合附图对本专利技术做进一步的详细描述。实施例一在本专利技术的实施例中提供了一种用于水稻细胞质鉴定的分子标记方法，包括以下步骤，请参考图1：步骤101：分析比对CW、Lead、Nipponbare和9311的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于水稻细胞质鉴定的分子标记方法，其特征在于，包括以下步骤：分析比对CW、Lead、Nipponbare和9311的线粒体基因组，筛选出不保守的MS序列；根据所述MS序列设计相应的分子标记PCR引物；提取不同品种的水稻的总DNA；以所述总DNA作为模板，以所述分子标记PCR引物作为引物进行PCR扩增，获得扩增产物；对所述扩增产物进行电泳检测，筛选出能够导致扩增差异的多态性引物，并获得利用该多态性引物扩增得到的目的条带；对利用所述多态性引物扩增获得的目标条带进行统计，建立聚类图，以进行亲缘关系分析。

【技术特征摘要】
1.一种检测用于水稻细胞质鉴定的分子标记的引物对，其特征在于，所述引物对有24对，其上游引物的核苷酸序列分别如SEQIDNO...

【专利技术属性】
技术研发人员：谢红卫，钱明娟，蔡耀辉，颜满莲，毛凌华，李永辉，聂元元，颜龙安，
申请(专利权)人：江西省超级水稻研究发展中心，
类型：发明
国别省市：江西;36