本发明专利技术公开了水稻小分子RNA osa-miRNA530在调控水稻叶夹角及叶片长度中的应用。本发明专利技术从水稻日本晴中分离克隆到microRNA osa-miR530，该microRNA的前体基因pre-miR530在水稻中过量表达后，发现转基因株系和野生型对照相比，过表达株系叶夹角和叶片长度均变小。因此，在水稻中过量表达osa-miR530对于减小叶夹角，提高种植密度，促进水稻产量提高具有重要意义，这为水稻高产分子育种提供新的资源和研究方法。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术设及植物基因工程领域，具体设及一种水稻小分子RNAosa-miRNA530在调 控水稻叶夹角及叶片长度中的应用。
技术介绍
水稻是一种重要的粮食作物，也是单子叶植物研究的模式植物。叶片形态是水稻 "理想株型"的重要组成部分，是当前水稻高产育种关注的重点。水稻叶片形态主要包括叶 片卷曲度、叶夹角、披散程度W及叶片大小等方面（徐静等，作物学报，2013, 39:767-774)。 研究表明，直立叶片群体的光合效率高于平展或弯垂叶，能够有效促进光合作用和种子灌 浆，从而提高水稻的产量。 前人研究表明，影响植株空间伸展姿态的叶夹角主要通过叶角基因调控油菜素 内醋的信号传导来影响叶枕细胞的生长发育，此外其他多种植物激素，包括乙締、生长素、 赤霉素，参与调控了植物叶夹角的大小。叶作为一种不对称性的侧生器官，在发育过程 中经历了 3个轴向的极性建成："基一顶"轴向（从叶基指向叶尖）、"近一远"轴向（上 表面一下表面）和"中一侧"轴向（由中脉指向左右两边叶缘）化assonetal.，CR Biologies, 2010, 333:350-360)。水稻叶片形态建成极性建立是一个复杂过程，参与调控因 子间形成相互调节和括抗网络。从目前的研究来看，I类KNOX基因家族，化及H-ZIPIII、 ΚΑΝΑDI和ARFs等基因家族的成员在水稻叶基顶轴、近远轴极性建立过程中具有重要作 用；同时，参与水稻侧生器官极性建立及发育过程的基因中还受microRNA和ta-siRNA的 调控。目前为止，所有已克隆的叶形调控基因间相互调控关系的研究还不够深入，还不能 明确水稻叶形建成和发育的分子调控网络。本专利技术从水稻日本晴中分离克隆到一个小分子 RNAosa-miR530,研究了其在调控水稻叶夹角和叶片长度方面的作用。Liu等已经在水稻中 预测了该microRNA的序列化iuBetal.，2005,PlantPhysiol, 139:296-305),但目前还 没有任何相关功能研究的报道。
技术实现思路
本专利技术从水稻日本晴中分离克隆到microRNAosa-miR530,该microRNA的前体基 因pre-miR530在水稻中过量表达后，发现转基因株系和野生型对照相比，过表达株系叶夹 角和叶片长度均变小。因此，在水稻中过量表达〇sa-miR530对于减小叶夹角，提高种植密 度，促进水稻产量提高具有重要意义，运也为水稻高产分子育种提供新的资源和研究方法。 本专利技术申请人W水稻的一个microRNAosa-miR530为研究对象，研究了 osa-miR530在改变水稻叶夹角及叶片大小方面的作用及应用。osa-miR530的成熟体序 列为20bp核酸序列（5'-TGCATTTGCACCTGCACCTA-3'；沈QIDN0:1)。其前体序列大小为 15化p(SEQIDN0:2)。本专利技术利用水稻日本晴叶片的cDNA作为模板，利用PCR的方法扩增 出水稻osa-miR530的前体基因，将其正向连接在植物表达载体pCAMBIA1390-ubi上，并通 过农杆菌介导的遗传转化方法转化水稻，从而获得超量表达〇sa-miR530的转基因水稻植 株。在T3代转基因植株中，阳性植株的叶夹角和叶片长度均显著低于非转基因对照植株。 叶夹角降低了约50%，长度降低约20-30%。 本专利技术的优点在于： (1)本专利技术首次分离克隆了 〇sa-miR530及其前体基因，并在水稻中过量表达了 osa-miR530。提供了一种通过调控miRNA的表达来调控叶夹角大小和叶片长度的方法。 (2)本专利技术的miRNA osa-miR530能成功调控水稻叶夹角和叶片长度，运有助于明 确osa-miR530在调控植物株型形态建成过程中的作用机制。 (3)由于植物microRNA序列和功能的高度保守性，本专利技术的结果对于研究水稻等 禾谷类作物W及其它植物miR530在植物株型调控中的作用具有重要价值。【附图说明】 图1为本专利技术的〇sa-miR530表达载体的构建示意图。将克隆在PMD18-T载体 上的osa-miR530利用BamHI和Spel酶切，替换pCAMBIA1390-ubi植物表达载体上BamHI 和Spel之间的DNA片段，运样osa-miR530正向插入玉米泛素基因启动子（Pubi)后，即 pCAMBIA1390-ubi-0sa-miR530 植物表达载体。 图2为检测T3代转基因水稻阳性植株中osa-miR530转录本相对表达水平结果 图。其中osa-miR530-〇x表示转osa-miR530的植株，#日-1、#日-4、抓-1、抓-2和#c-l代表 独立的阳性转基因株系；WT代表野生型水稻植株。邸-la作为巧光定量PCR分析的内参基 因。 图3为转osa-miR530水稻植株和野生型植株在成熟期叶夹角比较图。A图是成熟 期植株剑叶夹角比较图；B图是成熟期植株叶夹角对比统计图。其中osa-miR530-〇x表示 转osa-miR530的植株，#曰-1、抓-1和#c-l代表独立的阳性转基因株系；WT代表野生型水 稻植株。**表示根据TTEST统计学分析差异极显著任<0.01)。 图4为转osa-miR530水稻植株和野生型植株在成熟期叶片长度对比统计图。A图 是成熟期植株主茎剑叶和倒二叶叶片长度比较图；B图是成熟期植株剑叶和倒二叶叶片长 度对比统计图。其中〇sa-miR530-〇x表不转osa-miR530的植株，#日-1、抓-1和#c-l代表 独立的阳性转基因株系；WT代表野生型水稻植株。**表示根据TTEST统计学分析差异极显 著（P<0. 01)。【具体实施方式】 W下实施例是对本专利技术的进一步说明，并描述了本专利技术在分离克隆〇sa-miR530、 构建表达载体W及验证功能的方法。根据W下的描述和实施例，本领域技术人员可W确定 本专利技术的基本特征，并且在不偏离本专利技术精神和范围的情况下，可W对本专利技术做出各种改 变和修改，W使其使用不同的用途和条件。 实施例1 :osa-miR530前体基因DNA片段的克隆 采用TRIZ化试剂（Invitrogen)从水稻品种日本晴幼苗叶片中提取总RNA。具体步 骤如下：将20毫克叶片放至液氮预冷的研鉢中，加入液氮快速磨成粉末，将粉末装入1. 5ml 离屯、管中，迅速加入1mlTrizol(Invitrogen)颠倒混匀，室溫静置5分钟。在4°C，12000巧m 离屯、10分钟，取上清液移至新的1. 5ml离屯、管中。加入200μ1氯仿，用手剧烈摇动15秒 钟，室溫静置2-3分钟。4°C，12000巧m离屯、15分钟。取无色水相至一新的1. 5ml离屯、管 中，加入250μ1异丙醇，250μ1高盐溶液，颠倒混匀，室溫静置10分钟。4°C，12000rpm离 屯、10分钟，吸除上清液。加入1ml冰冷的75%乙醇，上下倒置几次，然后4°C，750化pm离屯、 5分钟，弃上清，在室溫下干燥至沉淀变透明。加入适量的DEPC水（一般为60μ1)溶解沉 淀，利用紫外分光光度计测定RNA的浓度。 利用反转录酶SuperscriptII(Invitrogen)将其反转录成cDNA，具体步骤如下： 依次加入 1μ1 500μ本文档来自技高网...
【技术保护点】
水稻小分子RNA osa‑miRNA530在调控水稻叶夹角及叶片长度中的应用。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：孙伟，徐晓辉，谢先芝，白波，郑崇珂，和亚男，程惠敏，
申请(专利权)人：山东省水稻研究所，
类型：发明
国别省市：山东;37
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