本发明专利技术公开了一种有效抑制小鼠PDK2表达的RNA干扰序列及其应用，RNA干扰序列如SEQ ID NO.3的第5～52位所示或如SEQ ID NO.5的第5～52位所示，该序列能够显著抑制小鼠PDK2表达，抑制表达后能够促进表达PDK2细胞的线粒体活性氧分泌，活化细胞，为肿瘤、I型糖尿病及肝炎等疾病的治疗提供了新的思路。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物医药领域，具体设及一种有效抑制小鼠PDK2表达的RNA干扰序 列，还设及该RNA干扰序列的应用。
技术介绍
线粒体中的丙酬酸脱氨酶复合体（pyruvatedehy化ogenaseComplex,PDC)能够 催化丙酬酸氧化脱簇生成NADH和乙酷辅酶A,并把糖酵解与Ξ簇酸循环W及ATP的生成紧 密地联系在一起。运一重要反应对于需要大量ATP的组织（如大脑、肌肉）来说至关重要。 通过PDC产生的乙酷辅酶A对于肝脏、脂肪运样能够产生脂肪的组织来说也是非常重要的， 因为线粒体中的乙酷辅酶A可W通过形成巧樣酸（胞体乙酷辅酶A前体）进入到脂肪酸的 合成过程。正是因为葡糖和脂肪酸之间存在运种底物竞争，所W高活性的PDC能够通过抑 制肉毒碱栋桐酷基转移酶来限制线粒体脂肪酸的摄取。由于在哺乳动物中不存在由乙酷辅 酶A逆转生成葡萄糖的通路，因此在葡萄糖缺乏的时候抑制PDC的活性对于葡萄糖的转化 至关重要。在肝糖元耗竭时，PDC反应的底物-丙酬酸作为葡萄糖合成的前体是肝脏和肾糖 异生所必须的。运就使得血糖维持在一个稳定的水平，W保证不能够使用其他底物的组织 获得ATP。除了脂肪酸氧化的产物（乙酷辅酶A和NADH)对PDC的异构抑制外，丙酬酸脱氨 酶激酶（Pyruvatedehy化ogenasekinase,PDK)通过憐酸化PDC也可W抑制其活性。PDC 被PDK憐酸化失活后限制了丙酬酸被完全氧化或转变成脂肪酸。同时，通过抑制PDK来增 加PDC的活性也是治疗糖尿病、屯、脏病W及肿瘤的药物祀点。 PDC是含有3个组分的复合体。运3个组分能够催化丙酬酸生成乙酷辅酶A:丙 酬酸脱氨酶（pyruvatedehy化ogenase，E1)、二氨硫辛酷胺乙酷基转移酶（dihy化olipoyl transacetylase，E2)W及二氨硫辛酷胺脱氨酶（dihy化olipoamidedehy化ogenase， E3)。El催化生理可逆的步骤：PDKW及丙酬酸脱氨酶憐酸酶（pyruvatedehy化ogenase 地os地at巧hosphatases，PD巧调节的正是运一活性。PDK和PDP催化可逆的憐酸化（失 活）和去憐酸化（激活）循环反应。E1的憐酸化主要发生在3个特异的位点：264位丝氨 酸（位点1)、271位丝氨酸（位点2)、203位丝氨酸（位点3)。位点1的憐酸化速度最快， 而位点3的憐酸化速度最慢。因此，位点1的憐酸化是根据代谢需要快速调节活性PDC比 例的主要位点。 在人类和晒齿类动物中目前鉴定出有4种PDK同工酶：PDK1、PDK2、PDK3W及 PDK4。其中PDK1在屯、脏、膜岛和骨骼肌中被检测到。而PDK2分布最广，在屯、脏、肝脏和肾 脏中高水平表达。PDK3组织表达相对较局限（睾丸、肾脏和脑）。PDK4在屯、脏、氧化型肌 肉、肝脏和肾脏等组织中高丰度表达。E1憐酸化位点突变分析表明，4种PDK都可W憐酸化 位点1和位点2 ;而位点3只能被PDK1憐酸化。对于位点2，PDK4比PDKUPDK2和PDK3现 出更高的活性。PDK2可能通过憐酸化位点1来短期抑制PDC。如果PDK对于PDC的运种憐 酸化调节异常，通常会引起一些人类疾病。 阳〇化]葡萄糖代谢产物能够高度调节PDK的活性。乳酸（由糖酵解产生或是血液循环 中）代谢产生的El的底物丙酬酸、NAD+W及辅酶A都对PDK活性起到抑制作用。而线粒 体中PDC反应和脂肪酸氧化的产物乙酷辅酶A及NADH能够激活PDK。故而，增加线粒体中 NADH/NAD+W及乙酷辅酶A/辅酶A的浓度比例可W增加PDK的活性。营养条件和激素能够 改变PDK的表达而影响葡萄糖-脂肪平衡。低血糖能够促使膜岛素的浓度降低从而使得脂 肪分解增加，并最终导致脂肪酸氧化水平增高、葡萄糖的利用降低W维持血糖平衡。膜岛素 在调节血糖中具有重要作用，它能促进葡萄糖氧化利用、抑制脂肪分解的作用。因此，饥饿 诱导的膜岛素水平降低可W加剧脂肪组织中来源于Ξ酷甘油的脂肪酸氧化代谢。给饥饿过 夜的大鼠注入膜岛素化后，骨骼肌中的PDK4在mRNA水平减少了 72%，同时在蛋白质水平 减少了 20%，而膜岛素憐酸化Akt和F0X01则在其中发挥了重要作用。 由于PDK2表达组织广泛，同时其参与了肿瘤、I型糖尿病及肝炎等的病理进程。因 此，特异抑制PDK2已经成为了运些疾病的新治疗祀标。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的之一在于提供一种有效抑制小鼠PDK2表达的RNA干扰序 列；本专利技术的目的之二在于提供含有所述RNA干扰序列的慢病毒表达载体；本专利技术的目的 之Ξ在于提供所述RNA干扰序列的制备方法；本专利技术的目的之四在于提供所述RNA干扰序 列或所述慢病毒载体在抑制小鼠PDK2表达中的应用；本专利技术的目的之五在于提供所述RNA 干扰序列或所述慢病毒载体在促进表达PDK2细胞的线粒体活性氧分泌中的应用。 为实现上述专利技术目的，经过大量实验，本专利技术提供如下技术方案： WPCR法扩增小鼠PDK2分子全长的核巧酸序列（Genebank:NM_133667. 2;GI: 226958642)，使用生物信息学及研究计算软件化ttp://si;rna.wi.mit.edu/home.地p)结 合DNAstar对PDK2的RNAi干扰序列进行预测。获得两个针对PDK2的特异性RNAi序列 (命名：PDK2RNAi-l和PDK2RNAi-2)，具体如沈QIDNO. 3的第5~52位所示或如沈QID NO. 5的第5~52位所示。 然后使用全基因合成方法合成RNAi序列，将SEQIDNO. 3与SEQIDNO. 4,或SEQ IDNO. 5与沈QIDNO. 6退火形成双链，然后经EcoRI和化cl酶切位点连入GVl15慢病毒 表达质粒，构建GV115慢病毒表达质粒。 对所获得慢病毒表达载体进行测序，正确无误后与包装质粒化Iper1. 0共转染 293T细胞，收集上清并浓缩，获得病毒颗粒。然后转染宿主细胞如RAW264. 7细胞，结果显示 转染细胞PDK2的表达受到显著抑制，其中PDK2RNAi-2效果最佳。此外，抑制PDK2表达可 促进RAW264. 7细胞线粒体活性氧（mtRO巧的分泌。 因此，所述RNA干扰序列或慢病毒载体可W用于抑制小鼠PDK2表达的应用。也可 W将RNA干扰序列或所述慢病毒载体在促进表达PDK2细胞的线粒体活性氧分泌中的应用。 其中表达PDK2细胞优选为巨隧细胞。 本专利技术的有益效果在于：本专利技术获得了有效抑制小鼠PDK2表达的RNA干扰序列， 能够显著干扰小鼠PDK2的表达，并且抑制PDK2表达可促进RAW264. 7细胞线粒体活性氧 (mtRO巧的分泌，能够提高细胞活性，增强免疫，能够用于肿瘤、I型糖尿病及肝炎等疾病的 治疗。【附图说明】 为了使本专利技术的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本专利技术提供如下附图： 图1为慢病毒表达载体GV115载体图谱。图2为第1条RNAi慢病毒转染效率进行分析，提示在M0I= 0. 1的条件下，其能 与有效感染Raw264. 7细胞（其中绿色为载体表达的GFP蛋白）。图3为第2条RNAi慢病毒转染效率进行分析。提示在M0I= 0. 1的条件下，其能 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种有效抑制小鼠PDK2表达的RNA干扰序列，其特征在于：所述RNA干扰序列如SEQ ID NO.3的第5～52位所示或如SEQ ID NO.5的第5～52位所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：陈永文，吴玉章，杨承英，
申请(专利权)人：中国人民解放军第三军医大学，
类型：发明
国别省市：重庆;85
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。