本发明专利技术涉及ＬＮＡ寡核苷酸，其由选自５′－（Ｔ↓［ｘ］）Ｇ↓［ｘ］Ｇ↓［ｘ］ｃ↓［ｓ］ａ↓［ｓ］ａ↓［ｓ］ｇ↓［ｓ］ｃ↓［ｓ］ａ↓［ｓ］ｔ↓［ｓ］ｃ↓［ｓ］ｃ↓［ｓ］Ｔ↓［ｘ］Ｇ↓［ｘＴ］－３′和５′－（Ｇ↓［ｘ］）Ｔ↓［ｘ］Ｔ↓［ｘ］ａ↓［ｓ］ｃ↓［ｓ］ｔ↓［ｓ］ｇ↓［ｓ］ｃ↓［ｓ］ｃ↓［ｓ］ｔ↓［ｓ］ｔ↓［ｓ］ｃ↓［ｓ］Ｔ↓［ｘ］Ｔ↓［ｘＡ］－３′的序列组成，其中大写字母代表β－Ｄ－氧－ＬＮＡ核苷酸类似物，小写字母代表２－脱氧核苷酸，下划线代表β－Ｄ－氧－ＬＮＡ核苷酸类似物或２－脱氧核苷酸，下标“ｓ”代表相邻核苷酸／ＬＮＡ核苷酸类似物之间的硫代磷酸酯键，且下标“ｘ”代表相邻核苷酸／ＬＮＡ核苷酸类似物之间的硫代磷酸酯键或磷酸二酯键，且其中所述序列可选地延伸至多５个２－脱氧核苷酸单元。所述ＬＮＡ寡核苷酸可以用于调节低氧诱导因子－１ａ（ＨＩＦ－１ａ）的表达，例如用于治疗癌症疾病，抑制血管发生，诱导细胞凋亡，防止细胞增殖，或治疗血管发生性疾病，例如糖尿病性视网膜病，黄斑变性（ＡＲＭＤ），银屑病，类风湿性关节炎和其它炎性疾病。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术提供了用于调节HIF-1a的表达的组合物和方法。更具体地，本专利技术涉及LNA寡核苷酸，其可以与编码HIF-1a的核酸特异性地杂交。已经证实，所述LNA寡核苷酸可调节HIF-1a的表达，并公开了其药物制品和它们治疗癌症疾病、炎性疾病和眼病的用途。
技术介绍
实体瘤必须建立血液供应并具有增强的葡萄糖代谢，才能生长到超过几毫米。它们如何感知低氧、并通过激活低氧诱导型基因和分泌血管发生因子来建立血系统作出反应，是癌症生物学的关键。许多肿瘤含有低氧微环境，已经将它们与恶性进展、转移和对放疗和化疗的抗性相关联。低氧诱导因子-1(HIF-1)的发现，提供了对低氧诱导型基因的调节的一些洞察(US 5,882,914和WO 96/39426；WO 99/48916)。HIF-1由2个亚基HIF-1α(HIF-1alpha；在本文中称作″HIF-1a″)和HIF-1β组成，它会结合编码血管生成因子(例如VEGF)和糖酵解相关蛋白(例如糖酵解酶和葡萄糖转运蛋白1和3(GLU-1和3))的基因的增强子中的-1低氧响应元件(HRE)。已经确认，反义HIF-1a质粒的肿瘤内基因转移对HIF-1a的工程化减量调节，会导致VEGA的减量调节和降低的肿瘤微血管密度(WO00/76497，Sun X等，Gene Therapy(2001)8，638-645)。该质粒含有编码HIF-1a的5′-末端(核苷酸152-454；Genebank AF003698)的320-bp cDNA片段。WO 2003/085110显示了可以减量调节人HIF-1a表达的LNA反义寡核苷酸。一种化合物称作CUR813(SEQ ID NO.11)。本专利技术公开了LNA寡核苷酸，其比CUR813(SEQ ID NO.11)更有效。另外，根据本专利技术的特异性LNA寡核苷酸会诱导细胞凋亡和抑制增殖。另外，与小鼠HIF-1a具有100％序列同一性的LNA寡核苷酸会减量调节小鼠肝、结肠和肾中的HIF-1a表达。专利技术简述本专利技术提供了用于调节HIF-1a的表达的组合物和方法。更具体地，本专利技术涉及涵盖靶向HIF-1a的2个特定基序的LNA寡核苷酸。这些基序公开为SEQ ID NO.3和4。更具体地，优选的LNA寡核苷酸是SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2。本专利技术的LNA寡核苷酸是HIF-1αmRNA表达和蛋白水平的有效抑制剂。更具体地，本专利技术提供了LNA寡核苷酸，其由选自下述的序列组成5′-(Tx)GxGxcsasasgscsastscscsTxGxT-3′(SEQ ID NO.3)和5′-(Gx)TxTxascstsgscscststscsTxTxA-3′(SEQ ID NO.4)其中大写字母代表β-D-氧-LNA核苷酸类似物，小写字母代表2-脱氧核苷酸，下划线代表β-D-氧-LNA核苷酸类似物或2-脱氧核苷酸，下标″s″代表相邻核苷酸/LNA核苷酸类似物之间的硫代磷酸酯键，且下标″x″代表相邻核苷酸/LNA核苷酸类似物之间的硫代磷酸酯键或磷酸二酯键，且其中在括号中的核苷酸单元(分别为(Tx)，(T)，或(Gx)，(A))代表可选存在的单元，且其中所述序列可选地延伸至多5个2-脱氧核苷酸单元。也提供了包含本专利技术的LNA寡核苷酸的药物组合物。还提供了调节细胞或组织中HIF-1a的表达的方法，其包含使所述细胞或组织接触一种或多种本专利技术的LNA寡核苷酸或组合物。还公开了通过施用治疗或预防有效量的一种或多种本专利技术的LNA寡核苷酸或组合物，治疗怀疑患有或易患与HIF-1a的表达有关的疾病或状况的动物或人的方法。另外，提供了使用LNA寡核苷酸抑制HIF-1a的表达和治疗与HIF-1a活性有关的疾病的方法。附图简述附图说明图1A显示了与SEQ ID NO.6相比，SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.5在大鼠血浆(NtacSD雄性，肝素锂(Taconic，M&B))中提高的稳定性。在37℃，以20μM浓度温育寡核苷酸0、4、或24小时。甚至在消化24小时后，没有检测到SEQ ID NO.1的降解片段。图1B显示了全长SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.13(SEQ ID NO.1的硫代磷酸酯，且相同序列)在大鼠和人血清中的稳定性。以20μM的终浓度，将寡核苷酸加入人或大鼠血清。该图表明，在37℃，LNA寡核苷酸在人和大鼠血清中长达1-96小时的稳定性。对于大鼠血清，图1B的倒数第二个图证实了甚至在48小时和96小时后仍持续的酶活性。作为阴性对照的后一个图证实，当在37℃、不加入血浆温育时，SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.13没有降解。图1C显示了SEQ ID NO.1在人和大鼠血浆中非常长的稳定性。在人或大鼠血浆中温育寡核苷酸1-96小时，然后上变性凝胶。用SyBr金染色后，使用磷光计测量全长产物的量，并相对于时间绘图。图2A显示了LNA寡核苷酸转染的U373细胞中的HIF-1a蛋白减量调节。用2或10nM化合物转染U373细胞，或模拟转染，在低氧下温育，并通过蛋白印迹分析HIF-1a蛋白减量调节。分析微管蛋白表达，作为等量上样的对照。图2B显示了用SEQ ID NO.1处理后U373成胶质细胞瘤癌细胞系中的HIF-1α蛋白减量调节。分析Pan-肌动蛋白表达，作为等量上样的对照。用0.2，1和10nM SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.10(它是SEQ ID NO.1的2bp mm)转染细胞。下图是凝胶的定量。图2C显示了用靶向HIF-1a的LNA寡核苷酸SEQ ID NO.1和含有LNA的杂乱对照寡核苷酸SEQ ID NO.8处理后24小时，U373细胞中的HIF-a表达的减量调节。将HIF表达与GAPDH或β-肌动蛋白相关联，并与未转染的对照(模拟品)相比。RNA纯化后，通过QPCR定量mRNA表达。图3A和3B显示了细胞凋亡的诱导，这通过用LNA寡核苷酸处理24-72小时后，常氧或低氧条件下成胶质细胞瘤细胞系U373中诱导的半胱天冬酶3/7活性的动态特征来测得。证实SEQ ID NO.1是早期细胞凋亡的有效诱导剂。图4A早期凋亡细胞期的诱导，这通过48小时后膜联蛋白V-FITC和PI流式细胞术分析测得。与模拟品和SEQ ID NO.12处理的细胞相比，将用LNA寡核苷酸SEQ ID NO.1处理的U373细胞分类成更″早期凋亡的″。图4B用SEQ ID NO.1处理后，U373细胞中早期细胞凋亡的诱导的定量。用不同剂量的SEQ ID NO.1处理后48小时，迫使进入早期细胞凋亡的细胞的百分比。用SEQ ID NO.1或两种不同的杂乱的对照寡核苷酸SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.12转染U373细胞。收获并与膜联蛋白V ab和PI温育后，通过流式细胞术测量早期细胞凋亡的细胞的数目。图5A和5B显示了转染并在低氧或常氧下温育后24-72小时，化合物转染的成胶质细胞瘤细胞系U373细胞。通过MTS测定测得，显示了SEQ ID NO.1是有效的增殖抑制剂。图6A和图6B显示了使用SEQ ID NO.1的两种给药方案的体内内源肝靶物减量调节。测量HIF-1α以及下游靶物VEGF的mRNA水平，证实本文档来自技高网...
【技术保护点】
ＬＮＡ寡核苷酸，其由选自下述的序列组成：５′－（Ｔ↓［ｘ］）Ｇ↓［ｘ］Ｇ↓［ｘ］ｃ↓［ｓ］ａ↓［ｓ］ａ↓［ｓ］ｇ↓［ｓ］ｃ↓［ｓ］ａ↓［ｓ］ｔ↓［ｓ］ｃ↓［ｓ］ｃ↓［ｓ］Ｔ↓［ｘ］Ｇ↓［ｘ］Ｔ－３′（ＳＥＱＩＤＮＯ．３） 和５′－（Ｇ↓［ｘ］）Ｔ↓［ｘ］Ｔ↓［ｘ］ａ↓［ｓ］ｃ↓［ｓ］ｔ↓［ｓ］ｇ↓［ｓ］ｃ↓［ｓ］ｃ↓［ｓ］ｔ↓［ｓ］ｔ↓［ｓ］ｃ↓［ｓ］Ｔ↓［ｘ］Ｔ↓［ｘ］Ａ－３′（ＳＥＱＩＤＮＯ．４）其中大写字母代表β－Ｄ －氧－ＬＮＡ核苷酸类似物，小写字母代表２－脱氧核苷酸，下划线代表β－Ｄ－氧－ＬＮＡ核苷酸类似物或２－脱氧核苷酸，下标“ｓ”代表相邻核苷酸／ＬＮＡ核苷酸类似物之间的硫代磷酸酯键，且下标“ｘ”代表相邻核苷酸／ＬＮＡ核苷酸类似物之间的硫代磷酸酯键或磷酸二酯键，且其中在括号中的核苷酸单元各自代表可选存在的单元，且其中所述序列可选地延伸至多５个２－脱氧核苷酸单元。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：FW拉斯马森，M韦斯特加德，HF汉森，CA斯鲁，
申请(专利权)人：桑塔里斯制药公司，
类型：发明
国别省市：DK[丹麦]
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