一株高效积累多聚磷酸盐的积磷小月菌工程菌及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一株高效积累多聚磷酸盐的积磷小月菌工程菌，为积磷小月菌(Microlunatus phosphovorus)JN459-M571，于2015年12月1日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.11770。本发明专利技术采用连续易错PCR方法体外突变ppk2基因的启动子，以JN459为出发菌，通过基因重组技术建立含有ppk2基因启动子突变体的菌株库，筛选获得在厌氧条件下分解多聚磷酸盐的能力下降，在好氧条件下合成多聚磷酸盐的能力无显著差异的JN459-M571菌株。本发明专利技术菌株在厌氧运行过程中比原始菌株JN459的Poly-P含量高2.4倍，可应用于污水处理厂的EBPR生物除磷工艺。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于微生物育种和生物
，具体设及一株高效积累多聚憐酸盐的积 憐小月菌工程菌及其应用。
技术介绍
当前水体富营养化问题相当严重，研究证实憐是引起水体富营养化的关键因子之 一，因此降低污水处理厂出水中的憐元素含量是控制水体富营养化的一项重要措施。目前 污水处理厂普遍采用增强型生物除憐系统巧nhancebiologicalphosphorusremoval, EBPR)作为首选的生物除憐技术。邸PR生物除憐功能的实现依赖于活性污泥中聚憐微生物 的聚憐作用，聚憐微生物是一类可W合成多聚憐酸盐的微生物总称，具有过量吸收水体中 可溶性憐并W多聚憐酸盐形式储存在菌体的特点。[000引积憐小月菌（Microluna化Sphosphovorus)是聚憐微生物的一个代表，其积累的 多聚憐酸盐任oly-巧能达到菌体干重的10%W上，在邸PR系统中具有很好的除憐效果。但 是与其他聚憐微生物一样，积憐小月菌存在一个合成和分解多聚憐酸盐的循环，即在好氧 的时候合成多聚憐酸盐，在厌氧的时候分解多聚憐酸盐W获得能量，维持菌体对GTP和ATP 的需求。积憐小月菌的运种特性影响了其在邸PR中的作用，特别是当邸PR系统出现供氧 不足时会导致出水总憐含量不能达到法定的排放标准。因此，开发一种在厌氧条件下分解 多聚憐酸盐能力大幅度降低的积憐小月菌具有非常重要的实际应用价值。 多聚憐酸盐激酶PPK2是催化积憐小月菌化ly-P和ATP/GTP之间可逆反应的关键 酶。好氧条件下细胞能量充足，PPK2在ATP/GTP的驱动下将可溶性憐催化合成化ly-P，厌 氧条件下PPK2催化化ly-P分解形成ATP/GTP，维持细胞的核巧酸库平衡，满足细胞的正常 生长需求。PPK2的特殊作用决定了不能采用失活ppk2基因的方式对积憐小月菌进行改造， 目前也尚未有关于通过改造ppk2基因启动子而获得高性能积憐小月菌的报道。
技术实现思路
阳0化]针对上述现有技术，本专利技术的目的是提供一株高效积累多聚憐酸盐的积憐小月菌 工程菌及其应用。通过改造ppk2基因的启动子，减弱低氧条件对ppk2基因的活化作用，降 低ppk2的表达水平，减少PPK2对化ly-P的分解，最终改善积憐小月菌积累化ly-P的性能。 为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案： 本专利技术的一个方面设及一种经定向改造的ppk2基因启动子，其具有如SEQ ID NO. 1所示的核巧酸序列，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个碱基形成的具有同等功 能的核巧酸序列。 本专利技术的另一个方面设及该启动子在低氧条件下降低ppk2表达水平中的应用。 本专利技术的还一方面设及一种积憐小月菌，其含有上述经定向改造的ppk2基因启 动子。 本专利技术的再一方面设及一株高效积累多聚憐酸盐的积憐小月菌工程菌，该菌株具 体为积憐小月菌（Mic;roluna1:usphosphovo;rus)JN459-M571。已于 2015 年 12 月 1 日保藏 于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中屯、（简称CGMCC，地址为北京市朝阳区北 辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所），保藏编号为CGMCCNO. 11770。 |；0〇11] 本专利技术的积憐小月菌（Mic;roluna1:usphosphovorus)JN459-M571与野生型积憐小 月菌JN459相比，卵k2基因启动子有3个碱基的变化，分别是-46位、-76位和-79位碱基 都由G变成A。 本专利技术的另一目的是提供一种菌剂，该菌剂的活性成分为积憐小月菌 (Microlunatusphosphovorus)JN459-M571〇 所述积憐小月菌（Mic;roluna1:usphosphovorus)JN459-M571和/或所述菌剂在制 备生物除憐剂中的应用也属于本专利技术的保护范围。 本专利技术还一个目的是提供一对用于定向改造（即体外突变）ppk2基因启动子的易 错PCR的引物，其引物序列分别如序列表中SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO. 3所示。 阳〇1引本专利技术的再一个目的是提供该积憐小月菌（Microluna化Sphosphovorus)JN459-M571的制备方法，采用连续易错PCR方法体外对ppk2基因的启动子进行突变，W 已有的积憐小月菌JN459为出发菌，通过同源重组技术建立含有ppk2基因突变启动子 的菌株库，测定好氧和厌氧运行条件下化ly-P含量的变化，筛选得到高性能积憐小月菌 JN459-M571。上游引物卵k2ProForward序列：GTCGAAATGTCGGAAGCCGTGC(沈Q IDNO. 2);下游引物卵k2ProReverse序列：TAACCCATTGTTCGCCCGGCAG(SEQ IDNO. 3)。 所述连续易错PCR方法体外突变ppk2基因启动子的具体方法为： (1)PCR反应体系：模板DNA2ul、PCR缓冲液加1、TaqDNA聚合酶lul、dATP 1~3ul、dTTP1~3ul、dGTP1~3ul、dCTP1~3ul、上游引物化1、下游引物化l、25mM MgClz!~8ul、5mMMnClzO~lul,补加超纯水至 50ul。 W20] 似PCR条件：预变性95°C5分钟，变性95°C30秒，退火52~60°C30秒，延伸 72°C2分钟，循环30次，终延伸8分钟。 第1次PCR的模板DNA来源于积憐小月菌JN459,第2次PCR及后续PCR的模板 DNA采用上次PCR产物。 所述含有ppk2基因突变启动子的菌株库的构建方法，具体步骤如下： (1)首先构建携带ppk2基因上下游同源臂的穿梭载体PMV30服，然后将连续易 错PCR产物用凝胶琼脂糖电泳分离后回收PCR产物，与上述穿梭载体PMV30服在Gibson CloningMasterMix作用下进行体外重组，转化大肠杆菌D册a,挑取转化子提取质粒进行 双酶切鉴定； (2)采用电击转化技术将重组PMV30服质粒转入JN459菌株，在同源重组作用下得 到一系列转化子，构建含ppk2基因启动子突变体的菌株库。本专利技术的有益效果： (1)本专利技术首次采用定向突变的方式筛选多聚憐酸盐激酶ppk2基因启动子的 突变体，同时通过检测好氧和厌氧运行条件下Poly-P含量变化获得高性能积憐小月菌JN459-M571，其厌氧条件运行24小时后化ly-P含量比野生型菌株高2. 4倍，可应用于污水 处理厂的邸PR生物除憐工艺，具有重要的经济价值和社会价值。 似本专利技术采用连续易错PCR方法体外突变多聚憐酸盐激酶ppk2的启动子序列， 减弱了低氧条件对ppk2基因的活化作用，降低了ppk2的表达水平，减少了PPK2对化ly-P 的分解，最终改善了积憐小月菌积累化ly-P的性能。 (3)本专利技术的积憐小月菌JN459-M571在厌氧条件下化ly-P分解速度大幅度降低， 而好氧条件下合成化ly-P性能无显著差异。 (4)本专利技术的积憐小月菌工程菌的制备方法，突变工作的效率高，针对性非常强， 降低了诱变育种的随机性和盲目性，符合微生物菌种的育种需要。【附图说明】 图1 :好氧和厌氧运行条件下对污水中可溶性憐的去除效果； 图2 :好氧和厌氧运行条件下化ly-P含量变化。【具体实施方式】本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种经定向改造的ppk2基因启动子，其特征在于，其具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个碱基形成的具有同等功能的核苷酸序列。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：钟传青，曹广祥，
申请(专利权)人：山东建筑大学，山东省医药生物技术研究中心，
类型：发明
国别省市：山东;37