一种调控水稻苗期耐热性基因TBZ1与应用制造技术

本发明专利技术涉及一种调控水稻苗期耐热性基因TBZ1与应用。基因TBZ1开放阅读框序列为：SEQ ID NO.1，其编码区的序列为：SEQ ID NO.2。含有所述的基因的载体为植物表达载体，适于在水稻中表达。用所述的载体转化植物的细胞或组织，并且将转化的植物细胞或组织培育成植株。本发明专利技术提供的水稻调控苗期耐热性基因TBZ1是一个新的水稻穗响应环境温度基因，该基因可以调控水稻苗期耐热能力。本发明专利技术的基因对培育耐热植物新品种，特别是培育耐热水稻新品种具有重要意义。为水稻育种及水稻穗发育机制研究提供了新的基因资源，可以在调控水稻苗期耐热方面得到应用。

【技术实现步骤摘要】
一种调控水稻苗期耐热性基因TBZ1与应用
本专利技术属于分子生物学领域，涉及一种调控水稻苗期耐热性基因TBZ1与应用。
技术介绍
随着全球气候变暖，高温热害已成为作物生长的主要限制因素之一。在全球气候持续变暖、短期高温频发的背景下，开展耐热相关基因的挖掘研究对促进水稻持续、安全生产意义重大。水稻响应高温信号的热击转录因子和热击蛋白有比较深入的研究，但对调控这些基因的上游元件还了解的很少，植物的高温逆境应答与其他环境因子如光信号存在联系，受多重调控，最新研究发现非洲野生稻中的HTT1基因作为蛋白酶体基因能调控水稻的耐热性。锌指蛋白是一类具有手指状结构域的转录因子，在基因表达、细胞分化、胚胎发育、增强抗逆性等方面具有重要的调控作用，对植物的生物发育和胁迫的响应是至关重要，在光调节植物生长发育中也不可替代。B-box型锌指蛋白基因属于编码的蛋白因子中都含有1个或2个由40-47个氨基酸残基组成的高度保守的B-box结构域的锌指蛋白。水稻耐热性是一个数量性状，存在多个调控位点，但现在已知的调控水稻耐热性的基因很少，本专利技术探究影响水稻调控苗期耐热性基因及其应用的方法，为人类进一步对水稻穗调控苗期耐热性机制完全识别，并运用分子育种技术定向改造控制耐热性的关键基因而提高水稻苗期耐热性。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种调控水稻苗期耐热性基因TBZ1与应用。本专利技术的技术方案为：一种调控水稻苗期耐热性基因TBZ1，开放阅读框序列为：SEQIDNO.1，其编码区的序列为：SEQIDNO.2。一种调控水稻苗期耐热性状的B-box锌指蛋白，具有SEQIDNo：3所示的氨基酸序列。一种含有所述的基因的载体。其为植物表达载体，适于在水稻中表达。例如，具有SEQIDNo：4所示的pUbi-OsTBZ1-RNAi的表达载体。一种宿主细胞，所述细胞含所述的基因，或者含有所述的载体。所述细胞选自大肠杆菌细胞、农杆菌细胞或植物细胞。一种影响植物苗期耐热性的方法，所述方法包括用所述的载体转化植物的细胞或组织，并且将转化的植物细胞或组织培育成植株。所述转化通过农杆菌介导法或基因枪法进行。所述植物为禾本科植物。本专利技术鉴定的水稻耐热因子TBZ1为B-box锌指蛋白中的BBX22基因，该基因的正常表达保证了水稻对高温一定程度的耐受性，通过基因工程改造适度提高其表达量能够进一步提高水稻的耐热性，从而达到增产的目的。当本专利技术的基因被用于改变水稻耐热性状时，可采用以下方法：(1)将本专利技术的水稻耐热基因TBZ1克隆到植物转化载体中；(2)将所构建的植物转化载体转化可再生水稻组织(或器官)并使本专利技术的水稻耐热基因在转化的组织中表达；(3)将被转化的组织(或器官)培养成植株。本专利技术构建的pUbi-OsTBZ1-RNAi表达载体，能特异的抑制OsTBZ1基因的表达，从而降低水稻的幼苗耐热性。本专利技术提供的水稻调控苗期耐热性基因TBZ1是一个新的水稻穗响应环境温度基因，该基因可以调控水稻苗期耐热能力。本专利技术的基因对培育耐热植物新品种，特别是培育耐热水稻新品种具有重要意义。为水稻育种及水稻穗发育机制研究提供了新的基因资源，可以在调控水稻苗期耐热方面得到应用。附图说明图1pCAMBIA1390载体图谱；图2pUbi-OSTBZ1-RNAi载体图谱；图3半定量PCR鉴定T1代转基因植株中OsTBZ1的表达水平；图4定量PCR鉴定T1代转基因植株中OsBBX22的表达水平；图5不同热胁迫时间OsTBZ1的相对表达量；图6热胁迫下野生型、转基因株系OsTBZ1-RNAi-2、OsTBZ1-RNAi-4的耐热表型；A1、A2、A3分别表示正常条件下的野生型、转基因株系OsTBZ1-RNAi-2、OsTBZ1-RNAi-4；B1、B2、B3分别表示热胁迫的野生型、转基因株系OsTBZ1-RNAi-2、OsTBZ1-RNAi-4。具体实施方式以下通过具体实施例对本专利技术进行详细的说明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的药材原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。实施例1OsTBZ1-RNAi载体构建本专利技术通过NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)网站中的BLAST工具进行OsTBZ1核酸序列与氨基酸序列的同源性分析，利用Rice-map(http://www.ricemap.org/index.jsp)网站分析OsTBZ1基因的结构特征，通过与水稻品种日本晴(OryzasativaLssp.)基因组序列比对，选择OsTBZ1基因mRNA中特异区域，人工合成了OsTBZ1-RNAi，通过speI和pstI两个酶切位点连入金斯瑞标准载体pUC7中，挑取已合成的含有OsTBZ1-RNAi的目的片段的pUC57菌丝，于5mL含Amp抗生素的LB液体培养基中，37℃摇床中培养过夜。再提取pUC57质粒。将提取的质粒，用SpeⅠ，PstⅠ两种内切酶进行双酶切反应。双酶切体系见表1。表1双酶切反应体系将上述试剂充分混合，置于PCR仪中37℃，反应2h30min。双酶切完成后，将双酶切产物进行凝胶电泳，切胶回收小的目的片段，再进行DNA产物纯化。[具体为：设计与OsTBZ1的mRNAt特异序列反向互补序列，通过金斯瑞公司的DNA片段人工合成技术获得互补正向序列+间隔序列+互补反向序列的OsTBZ1特异的回文序列，通过speI和pstI两个酶切位点连入金斯瑞标准载体pUC7中，通过特异引物(actagtgagagaga；atactcctactacatgtac)PCR验证和测序验证选择测序正确的阳性克隆用于RNAi干涉(RNAinterference,RNAi)载体构建。]目的片段连入表达载体：将上一步得到的目的片段OsTBZ1-RNAi连入pCUbi1390表达载体中如图1所示。再进行质粒PCR检测，反应体系见表2。表2质粒PCR反应体系若得到目的片段正确，则目的基因OsTBZ1-RNAi连接入pCUbi1390表达载体中，载体构建成pUbi-OsTBZ1-RNAi表达载体，如图2所示。实施例2OsTBZ1-RNAi表达载体的遗传转化(1)农杆菌感受态细胞的制备取保存于-80℃的根癌农杆菌EHA105，将其在含有利福平(50ug/mL)的YEB平板上划线，置于28℃培养2天。从YEB平板上挑取农杆菌的单菌落，将其接种于5mL的YEB液体培养基中，置于摇床200rpm，28℃振荡培养过夜。取过夜培养的菌液2mL，接种于50ml的YEB液体培养基中，同样处于200rpm，28℃振荡培养，直到OD600达到0.5。将菌液移至无菌离心管中，冰浴30min，再5000rpm，离心10min，弃上清，收集菌体。再将收集的菌体悬浮于10mL，0.15mol/L预冷的NaCl中，5000rpm，离心10min，弃去上清。将收集的菌体重悬浮于1mL，20mmol/L预冷的CaCl2溶液中。将农杆菌悬浮液分装于1.5mL无菌离心管中，每管200uL置于液氮中速冻1min，﹣80℃冰箱保存以备用。(2)表达载体转入农杆菌感受态细胞将农杆菌EHA105感受态细胞置于冰上，取1uL含有目的基因的重组质粒载体加入到其中，充分混匀后，在冰上放置3本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种调控水稻苗期耐热性基因TBZ1，其特征在于开放阅读框序列为：SEQ ID NO.1，其编码区的序列为：SEQ ID NO.2。

【技术特征摘要】
1.一种调控水稻苗期耐热性基因TBZ1，其特征在于开放阅读框序列为：SEQIDNO.1，其编码区的序列为：SEQIDNO.2。2.一种调控水稻苗期耐热性状的B-box锌指蛋白，其特征在于具有SEQIDNo：3所示的氨基酸序列。3.一种含有权利要求1所述的基因的载体。4.根据权利要求3所述的载体，其特征在于其为植物表达载体，适于在水稻中表达。5.根据权利要求4所述的载体，其特征在于具有SEQIDNo：4所示的pUbi-OsTBZ1-RNAi的表达载体。6.一种宿主细胞，其特征在于所述细胞含...

【专利技术属性】
技术研发人员：汪启明，饶力群，朱建华，骆鹰，屠小菊，
申请(专利权)人：湖南农业大学，
类型：发明
国别省市：湖南,43