基于KASP技术用于水稻产量基因分型的引物组合及其应用制造技术

本发明专利技术提供一套基于KASP技术开发的用于水稻产量基因分型的引物组合，所述水稻产量基因包括Gn1a、NAL1、Ghd7、Hd1、Ghd7.1和Ghd8，所述引物组合的序列分别如SEQ ID NO:1‑18所示。利用本发明专利技术提供的成套KASP功能标记及其引物组合能够快速检测水稻种质中产量基因功能等位基因的组合方式，检测结果准确可靠，操作简单，成本低。本发明专利技术方法能够实现水稻育种材料重要产量功能基因的检测，为水稻高产新品种选育、改良提供科学指导。

Primer combination for rice yield gene typing based on KASP technology and its application

The present invention provides a set based on the KASP technology for the development of primer combinations yield of rice genotypes, the yield of rice genes including Gn1a, NAL1, Ghd7, Hd1, Ghd7.1 and Ghd8, respectively. The sequence of the primer combinations such as SEQ ID NO:1 18 shows. The set of KASP functional markers and primer combinations provided by the invention can rapidly detect combinations of yield gene function alleles in rice germplasm, and the detection result is accurate and reliable, and the operation is simple and the cost is low. The method of the invention can realize the detection of important production function genes of rice breeding materials, and provide scientific guidance for the breeding and improvement of new high-yielding rice varieties.

【技术实现步骤摘要】
基于KASP技术用于水稻产量基因分型的引物组合及其应用
本专利技术涉及分子生物学及作物育种
，具体地说，涉及一种基于KASP技术用于水稻产量基因分型的引物组合及其应用。
技术介绍
近年来，育种家通过系谱法育成大量的高产水稻品种。但是传统杂交和回交选择往往需要大规模的群体，开展大量的表型考察工作，并且许多表型考察难度大，这样极大地增加了育种的工作量和成本。随着水稻重要基因的克隆，开发基因功能位点的分子标记，检测育种材料中目标性状的基因组合类型，根据特定的育种改良目标，导入相应优良基因，培育新品种，已经成为可能。另外，育种过程中许多性状如产量性状，易受环境影响，不容易准确调查，而利用控制该性状的重要基因等位变异组合进行鉴别，可以代替性状表型考察，且不受环境影响，增加了选择的准确性，提高了选择效率，加速育种进程。水稻产量是由数量性状位点控制的。目前，通过遗传分离群体已克隆了多个主效产量基因，如Gn1a、NAL1、Ghd7、Hd1、Ghd7.1、Ghd8。这些基因序列均存在广泛的自然变异。如Gn1a编码区第1605位的碱基变异导致氨基酸变化，依据该单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism,SNP)可将核心种质材料Gn1a分作两种单倍型，二者存在极显著的产量差异。Ghd7.1编码区域一个8bp缺失，造成氨基酸翻译移码，导致基因功能丧失。因此，利用导致基因功能变异的碱基位点开发标记，进行育种材料的有利等位变异鉴定，在水稻高产品种培育中具有重要作用。然而，传统的连锁标记主要是基于与基因连锁的分子标记进行基因型鉴定，不能用来准确鉴定材料目标性状有利基因单倍型组合以及进行定向的改良育种，并且操作复杂、通量小、劳动力消耗量大。另外，由于不同基因增加水稻产量的作用途径不同，如Gn1a主要改良穗型，增加每穗颖花数，NAL1主要增加叶片光合作用面积，改良株型，而Hd1、Ghd7、Ghd7.1、Ghd8能够同时改良多个性状(每穗颖花数，开花期等)，因此，可以通过同时改良多个产量构成因子，进行高产育种。因而，开发成套相关基因的功能标记，可以利用分子标记辅助选择(Marker-assistedselection,MAS)技术针对不同育种材料作某个性状的定向改良，也可以进行多性状的聚合改良。KASP基因分型技术是一项独特的竞争型等位基因特异性PCR，可对各种基因组核酸样品进行SNPs和Indels(insertiondeletion)高精度双等位基因分型。KASP技术操作简单，分析稳定、准确，并且成本较低。水稻基因组大小约400Mb，经探索发现20-50ngDNA为最适宜的模板用量，利用上述6个基因功能位点开发的分子标记，对育种材料的产量基因位点进行有利等位基因的鉴别以及组合筛选，进行特定有利基因的转移和聚合，可提高产量水平。从而可以避免传统育种中的盲目性，极大地减小群体规模，节省成本，同时增加选择的准确性和效率。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一套基于KASP技术用于水稻产量基因分型的引物组合及其应用。为了实现本专利技术目的，本专利技术提供一套基于KASP技术开发的用于水稻产量基因分型的引物组合，其中所述水稻产量基因包括Gn1a、NAL1、Ghd7、Hd1、Ghd7.1和Ghd8，它们的功能性分子标记分别对应于表1中M1～M6，信息如下：表1编号分子标记类型物理位置等位基因M1SNPLOC_Os01g10110基因编码区第1605位[T/G]M2SNPLOC_Os04g52479基因编码区第698位[A/G]M3IndelsLOC_Os06g1637基因编码区第1053-1056位[AAAG/-]M4SNPLOC_Os07g15770基因编码区第455位[A/G]M5IndelsLOC_Os07g49460基因编码区第1516-1523位[AACGTTGT/-]M6SNPLOC_Os08g07740基因编码区第566位[A/C]基于KASP技术的用于检测上述功能性分子标记的引物组合，所述引物组合的信息见表2：表2本专利技术还提供含有所述引物组合的用于水稻产量基因分型的检测试剂盒。本专利技术还提供所述引物组合或试剂盒在改良水稻品种中的应用。本专利技术还提供所述引物组合或试剂盒在鉴定高产水稻品种中的应用。本专利技术还提供所述引物组合或试剂盒在水稻分子标记辅助育种中的应用。本专利技术进一步提供所述引物组合或试剂盒在水稻产量基因等位功能变异检测中的应用。所述应用包括以下步骤：1)提取待测水稻样品的DNA；2)取模板DNA2.5μl，引物混合液0.07μl，2×KASPMasterMix2.5μl，进行PCR扩增；引物混合液中引物fam-F、引物hex-F终浓度均为12μM，引物R终浓度为25μM；3)采用荧光检测仪分析PCR扩增产物单倍型。PCR反应条件为：94℃预变性15分钟；第一步扩增反应：94℃变性20秒，61℃-55℃梯度退火并延伸60秒，10个循环，每个循环退火及延伸的温度降低0.6℃；第二步扩增反应，94℃变性20秒，55℃退火并延伸60秒，32个循环。本专利技术具有以下优点：(一)利用本专利技术提供的成套KASP功能标记及其引物组合能够快速检测水稻种质中产量基因的功能等位基因的组合方式，检测结果准确可靠，操作简单，成本低。(二)本专利技术方法能够实现水稻育种材料的重要产量功能基因的检测，为水稻高产新品种选育、改良提供科学指导。附图说明图1-图6分别为本专利技术实施例2中6个基因功能位点标记Gn1a、Nal1、Hd1、Ghd7、Ghd7.1和Ghd8在12份材料间的基因型簇图。图7为本专利技术实施例3中日本晴/珍汕97育种改良路线图。图8为本专利技术实施例4中明恢63/珍汕97育种改良路线图。具体实施方式以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(SambrookJ&RussellDW,MolecularCloning:aLaboratoryManual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。实施例1水稻重要产量基因功能标记的开发1、根据文献AshikariM,SakakibaraH,LinS,etal.Cytokininoxidaseregulatesricegrainproduction[J].Science,2005,309(5735):741-745.；WangJ,XuH,LiN,etal.ArtificialselectionofGn1aplaysanimportantroleinimprovingriceyieldsacrossdifferentecologicalregions[J].Rice,2015,8(1):37。Gn1a对应于MSU基因编号：LOC_Os01g10110，该基因编码区第1605位SNP：T/G变异直接导致基因功能差异。2、根据文献FujitaD,TrijatmikoKR,TagleAG,etal.NAL1allelefromaricelandracegreatlyincreasesyieldinmodernindicacultivars[J].ProceedingsoftheNationalAcad本文档来自技高网...

【技术保护点】
基于KASP技术开发的用于水稻产量基因分型的引物组合，其特征在于，所述水稻产量基因包括Gn1a、NAL1、Ghd7、Hd1、Ghd7.1和Ghd8，它们的功能性分子标记分别对应于表1中M1～M6，信息如下：表1

【技术特征摘要】
1.基于KASP技术开发的用于水稻产量基因分型的引物组合，其特征在于，所述水稻产量基因包括Gn1a、NAL1、Ghd7、Hd1、Ghd7.1和Ghd8，它们的功能性分子标记分别对应于表1中M1～M6，信息如下：表1编号分子标记类型物理位置等位基因M1SNPLOC_Os01g10110基因编码区第1605位[T/G]M2SNPLOC_Os04g52479基因编码区第698位[A/G]M3IndelsLOC_Os06g1637基因编码区第1053-1056位[AAAG/-]M4SNPLOC_Os07g15770基因编码区第455位[A/G]M5IndelsLOC_Os07g49460基因编码区第1516-1523位[AACGTTGT/-]M6SNPLOC_Os08g07740基因编码区第566位[A/C]基于KASP技术的用于检测上述功能性分子标记的引物组合，所述引物组合的信息见表2：表22.含有权利要求1所述引物组合的用于水稻产量基因分型的检测试剂盒。3.权利要求1所述引物组合或权...

【专利技术属性】
技术研发人员：余四斌，袁志阳，孙文强，熊银，龚蓉，张佳宁，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42