基于苗期地上部标准化镉富集系数及usw47标记筛选小麦籽粒镉高低积累品种的方法技术

本发明专利技术公开了一种基于苗期地上部标准化镉富集系数及usw47标记筛选小麦籽粒镉高低积累品种的方法，属于育种技术领域。本发明专利技术方法包括如下步骤：收集100种以上不同品种的小麦；在镉浓度1.0±0.2mg/kg的土壤进行小麦苗期培养，采集10‑15天苗期叶片样品提取DNA，进行usw47标记检测；收获三叶期样品测定镉含量；根据小麦品种的苗期地上部镉富集系数对其进行0‑1标准化，得到苗期地上部标准化镉富集系数；根据标准化镉富集系数<0.3、>0.8，及usw47标记的检测结果来确定小麦品种为籽粒镉高、低积累品种。本发明专利技术方法简单，可操作性强，成本低廉，准确性高，适用性广，具有十分重要的意义。

Method for screening cadmium accumulation and accumulation of wheat grain based on standardized enrichment coefficient of CD and usw47 markers at Seedling Stage

The invention discloses a method for screening cadmium accumulation and accumulation varieties of wheat grain based on the standardized enrichment coefficient of cadmium in the upper part of the seedling stage and the usw47 mark, belonging to the breeding technical field. The method comprises the following steps: collecting more than 100 different varieties of wheat; wheat seedling cultivation in CD 1 + 0.2mg/kg soil, collected 10 15 day seedling leaf samples were extracted from DNA, usw47 markers; harvest period samples determination of cadmium content; according to the upper part of wheat seedling to cadmium enrichment coefficient 0 of the 1 standard, obtained seedlings standard cadmium enrichment coefficient; according to the standard of cadmium enrichment coefficient of < 0.3, > 0.8, the detection results and usw47 markers to determine the wheat varieties with high and low grain Cd accumulation varieties. The invention has the advantages of simple method, strong operability, low cost, high accuracy, wide applicability and great significance.

【技术实现步骤摘要】
基于苗期地上部标准化镉富集系数及usw47标记筛选小麦籽粒镉高低积累品种的方法
本专利技术属于育种
具体涉及一种基于苗期地上部标准化镉富集系数及usw47标记筛选小麦籽粒镉高低积累品种的方法。
技术介绍
镉(Cd)是自然界中毒性最大的重金属元素之一，其迁移性强、毒性大、极易被作物吸收和累积，通过食物链最终富集在人体，严重影响人类健康。2014年环境保护部和国土资源部公布的《全国土壤污染状况调查公报》显示，土壤环境总体不容乐观，镉源污染物位点超标率达7％，镉污染耕地面积超过20万hm2，由重金属污染造成直接危害包括全国年均粮食减产1000万吨以上，经济损失超200亿元(胡鹏杰，李柱，钟道旭，等.我国土壤重金属污染植物吸取修复研究进展[J].植物生理学报，2014(5)：577-584.)。镉对人体肾、肺、肝、睾丸、脑、骨骼及血液系统均可产生毒性，其在体内的生物半衰期长达10-30年，为已知的最易在体内蓄积的毒物(刘毅.镉的危害及其研究进展(综述)[J].中国城乡企业卫生,2003(4):12-13.)。通过筛选小麦镉高低积累品种，发掘籽粒镉含量低的种质资源，是解决镉危害的一种经济有效的措施。同时小麦是中国第二大粮食作物，在我国的粮食安全中占有重要地位。小麦作为镉中积累型作物，其籽粒镉含量要高于水稻、玉米等粮食作物(邢维芹，张红毅，ScheckelKG，等.铅冶炼污染区小麦籽粒镉含量及低积累品种筛选[J].农业环境科学学报，2015(10)：2039-2040.)。鉴于不同基因型小麦籽粒镉含量存在显著差异，故筛选镉高低积累品种具有必要性及可行性。已知的小麦镉高低积累品种的筛选方法有传统筛选法、模型预测法等。传统筛选法通过全生育培养并测定小麦成熟期籽粒的镉含量，利用统计分析方法筛选小麦籽粒镉高、低积累品种。传统分析方法筛选小麦籽粒镉高低积累品种的优点在于其准确性与真实性，真实反应小麦自然生长环境下对镉的累积能力，因此其他筛选方法的开发均需要建立在传统分析测试的基础上进行。但传统分析测试方法的缺点也非常明显，首先小麦正常生育期很长，其次小麦籽粒镉含量受土壤镉浓度、pH值、施肥习惯等多因素影响，通常需要多年多点试验方可确定镉高低积累品种。也有相关研究者通过苗期指标、土壤pH等数据建立相关数学模型，快速预测籽粒镉含量，但由于小麦全生育期不同部位镉含量的分布均会对最终籽粒镉含量造成影响，某些苗期镉累积能力强的品种成熟期籽粒镉含量反而不高，因此这种方法也存在一定不确定性。分子标记作为一种常用的分子生物学技术，已经广泛地应用于各个领域的研究，而将分子标记技术应用于筛选镉高低积累的作物品种是一种比较新颖且可行的方法。通过发掘与作物Cd积累相关的基因，并建立相关的分子标记，可以将其作为快速筛选作物Cd低积累品种的一种辅助手段。若是采用常规种质资源筛选手段，土壤镉浓度的变差引起的籽粒镉浓度差异，因此很难有统一的标准进行镉高低积累品种的筛选，而利用分子标记进行小麦镉高低积累品种筛选理论上可以避免这一现象。Wiebe等(2010)在Cdu1(反映小麦镉富集能力的主效基因)的基础上开发了一个与作物镉吸收性状基因变异共分离的EST衍生标记(XBF474090)，该标记已经被成功转化为一个共显性CAPS标记(基于PCR)，并被定名为usw47(WiebeK,HarrisNS,FarisJDetal.TargetedmappingofCdu1,amajorlocusregulatinggraincadmiumconcentrationindurumwheat(TriticumturgidumL.vardurum)[J].Theoreticalandappliedgenetics,2010,121(6):1047-1105.)。前人对这该标记有了一定的研究，但试验的小麦品种还是局限于典型的镉高、低积累品种，而未涉及大量未知小麦种质资源的筛选。本专利技术试验中当大量镉高、中、低积累型小麦品种共存时，usw47标记的有效性就大大降低，远无法达到筛选小麦籽粒镉高低积累品种的要求。本专利技术利用苗期地上部标准化镉富集系数与usw47标记相结合的方式，来筛选小麦籽粒镉高低积累品种，最大化地消除单独利用以上两种方式筛选的不足。在提升筛选效率的同时提高了小麦籽粒镉高低积累品种筛选的准确性。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种准确、快速、适用性广及可操作性强的筛选小麦籽粒镉高低积累品种的方法，该方法进一步提高了分子标记usw47的有效性，通过苗期地上部标准化镉富集系数+分子标记的两步法进行，相比以往小麦镉高低积累种质筛选方法显著提升了小麦籽粒镉高低积累品种筛选的准确性。为了实现上述的目的，本专利技术采取以下技术方案：一种基于苗期地上部标准化镉富集系数及usw47标记筛选小麦籽粒镉高低积累品种的方法，包括如下步骤：(1)收集100种以上不同品种的小麦。(2)选取镉浓度1.0±0.2mg/kg的土壤进行小麦苗期培养。(3)出苗15-20天，采集小麦幼叶叶片样品提取DNA。(4)利用usw47标记检测不同小麦品种的DNA：以所提取DNA为模板，使用引物F：5’-gctaggacttgattcattgat-3’、R：5’-agtgatctaaacgttcttata-3’进行PCR扩增；PCR产物经Hpy188Ⅰ限制性内切酶酶切，酶切产物通过琼脂糖凝胶电泳检测。(5)小麦苗期镉含量获取1)获取镉胁迫下小麦苗期地上部样品；小麦苗期优选三叶期；2)收获的样品洗净、烘干、粉碎后测定镉含量。(6)苗期地上部标准化镉富集系数(0-1标准化)的获得根据如下公式计算苗期地上部标准化镉富集系数(0-1标准化)：X标准值＝(X1-Xmin)/(Xmax-Xmin)；式中，X标准值为0-1标准化后的苗期地上部标准化镉富集系数，X1为计算所得的苗期地上部镉富集系数，Xmin为所有小麦品种中苗期地上部镉富集系数的最小值，Xmax为所有小麦品种中苗期地上部镉富集系数的最大值，苗期地上部镉富集系数＝苗期地上部镉含量/土壤实际镉含量。(7)确定小麦籽粒镉高低积累品种1)苗期地上部标准化镉富集系数大于0.8，且usw47标记特异性条带为225bp的小麦品种为籽粒镉高积累品种；2)苗期地上部标准化镉富集系数小于0.3，且usw47标记特异性条带为375bp的小麦品种为籽粒镉低积累品种。本专利技术利用大数据分析了分子标记(usw47)与小麦真实镉累积能力的相关性，结合分子标记以及苗期地上部标准化镉富集系数，建立了更加快速、经济、合理有效的以苗期地上部标准化镉富集系数、分子标记为基础的小麦镉低积累品种快速筛选方法，鉴于我国的实际国情，本专利技术具有十分重要的理论和现实意义。本专利技术与现有技术相比，具有以下优点和效果：(1)创新性：首次利用大田试验分析大量镉累积能力未知的小麦品种的真实镉积累能力与分子标记的相关性。采用苗期地上部标准化镉富集系数与分子标记结合的筛选小麦籽粒镉高低积累品种，相比单独利用苗期镉累积能力或分子标记进行筛选，鉴别准确率显著提高。(2)成本低廉：实际生产仅需进行DNA抽提、相关标记的检验、苗期镉含量测定，常规实验室均可完成，成本较低。(3)适用性广：由于本专利技术选取的小麦品种数量庞大，分本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于苗期地上部标准化镉富集系数及usw47标记筛选小麦籽粒镉高低积累品种的方法，其特征在于：包括如下步骤：（1）收集100种以上不同品种的小麦；（2）选取镉浓度1.0±0.2mg/kg的土壤进行小麦苗期培养；（3）出苗15‑20天，采集小麦幼叶叶片样品提取DNA；（4）利用usw47标记检测不同小麦品种的DNA：以所提取DNA为模板，使用引物F：5’‑gctaggacttgattcattgat‑3’、R：5’‑agtgatctaaacgttcttata‑3’进行PCR扩增；PCR产物经Hpy 188Ⅰ限制性内切酶酶切，酶切产物通过琼脂糖凝胶电泳检测；（5）小麦苗期镉含量获取1）获取镉胁迫下小麦苗期地上部样品；2）收获的样品洗净、烘干、粉碎后测定镉含量；（6）苗期地上部标准化镉富集系数的获得根据如下公式计算苗期地上部标准化镉富集系数：X

【技术特征摘要】
1.一种基于苗期地上部标准化镉富集系数及usw47标记筛选小麦籽粒镉高低积累品种的方法，其特征在于：包括如下步骤：（1）收集100种以上不同品种的小麦；（2）选取镉浓度1.0±0.2mg/kg的土壤进行小麦苗期培养；（3）出苗15-20天，采集小麦幼叶叶片样品提取DNA；（4）利用usw47标记检测不同小麦品种的DNA：以所提取DNA为模板，使用引物F：5’-gctaggacttgattcattgat-3’、R：5’-agtgatctaaacgttcttata-3’进行PCR扩增；PCR产物经Hpy188Ⅰ限制性内切酶酶切，酶切产物通过琼脂糖凝胶电泳检测；（5）小麦苗期镉含量获取1）获取镉胁迫下小麦苗期地上部样品；2）收获的样品洗净、烘干、粉碎后测定镉含量；（6）苗期地上部标准化镉富...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙学成，胡承孝，谭启玲，夏亦涛，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42