利用CRISPR\Cas9系统对水稻TDR基因进行定点突变及检测的方法技术方案

隐性雄性不育在植物育种中具有重要利用价值，水稻中TDR基因功能缺失会引起彻底的隐性雄性不育，因而是基因工程创制隐性雄性不育的重要靶标。本发明专利技术公开了一种利用CRISPR\Cas9系统对水稻TDR基因进行定点突变的方法，通过本发明专利技术提供的定点突变方法可快速高效地创制TDR基因突变体从而获得隐性雄性不育材料；本发明专利技术进一步提供了一种对通过前述定点突变方法获得的特定TDR突变基因型进行检测的方法，可用于快速鉴定TDR定点突变当代转化子中靶位点是否存在突变，亦可用于后代特定突变基因型的基因分型鉴定。

【技术实现步骤摘要】
利用CRISPR\Cas9系统对水稻TDR基因进行定点突变及检测的方法
本专利技术属于水稻分子育种
，涉及一种利用CRISPR\Cas9系统对水稻TDR基因进行定点突变的方法，并进一步提供一种对通过此种定点突变方法获得的特定TDR突变基因型进行检测的高分辨率溶解曲线分析方法。
技术介绍
隐性雄性不育株系在水稻育种中具有重要应用价值，目前已成功应用于轮回选择育种，也被应用于SPT技术(Seedproductiontechnology，一种植物雄性不育系生产技术)。水稻中克隆了很多隐性雄性不育基因，其中TDR基因失活导致的败育十分彻底，为无花粉型败育易于田间观察识别，不影响育性之外的农艺性状，因而具有重要利用价值。尽管已经存在TDR基因的突变体，但通过回交的方式向目标品种中导入该基因的突变体较为耗时费力，而且遗传背景不容易纯化，而通过定点基因突变技术对TDR基因进行诱变则更加便捷，而且可使目标材料遗传背景基本保持不变。基因的定点突变可通过基因编辑技术进行。基因编辑系统主要包括锌脂蛋白核酸酶(ZFN)、类转录因子效应蛋白核酸酶(TALEN)及CRISPR系统等[Gaj,T.,etal.ZFN,TALEN,andCRISPR/Cas-basedmethodsforgenomeengineering.TrendsBiotechnol,2013,31(7):397-405]，这些技术中应用最为广泛的是CRISPR\Cas9系统。通过CRISPR\Cas9系统创制的突变一般是1至数个碱基的缺失/插入(InDel)突变，当需要确定候选基因编辑植株中发生的具体序列变化时，一般通过DNA测序进行鉴定。在确定基因突变情况后，一般要在对基因编辑株系后代中进行去除标记的纯合突变单株的筛选，最后一般选择个别株系进行应用。特别地，在隐性雄性不育基因的基因编辑及应用中，有时需要在可育株中区分杂合型和野生型，而通过表型无法区分，因而只能通过一定的基因分型方法在基因水平上进行鉴定。高分辨率溶解曲线是一种新型的高通量基因分型方法，与野生型序列差异为少数几个碱基的突变难以通过普通PCR结合普通电泳的方法进行检测，而高分辨率溶解曲线分析法可对一些插入/缺失突变(InDel)和单碱基突变(SNP)进行基因分型。高分辨率溶解曲线分析基于特定核酸荧光染料的PCR并借助特定仪器进行，在遗传和育种研究的多个方面得到了应用。
技术实现思路
针对回交利用水稻现成隐性雄性不育基因tdr耗时费力、遗传背景难以纯化的缺点，本专利技术提供了一种利用CRISPR\Cas9系统对水稻野生型TDR基因进行定点突变的方法，并进一步提供了一种对定点突变获得的特定TDR突变基因型进行检测的方法。为了实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：第一方面，本专利技术公开了一种利用CRISPR\Cas9系统对水稻野生型TDR基因进行定点突变的方法，所述的TDR基因编码与SEQIDNo.1所示序列相同或存在95％以上序列相似性的水稻蛋白质序列，所述的CRISPR\Cas9系统采用的sgRNA引导序列(guidesequence)包括转义为DNA序列形式表示的如SEQIDNo.2或SEQIDNo.3所示的任一序列，或与SEQIDNo.2或SEQIDNo.3所示序列存在1至3个碱基差异的序列。优选地，所述的CRISPR\Cas9系统的功能组分组装在双元Ti质粒载体中，所述的双元Ti质粒载体包括pCUbi1390Cas9-U3或pCUbi1390Cas9-U6。更优选地，所述的双元Ti质粒载体为pCUbi1390Cas9-U3时，采用的CRISPR\Cas9系统sgRNA引导序列选自转义为DNA序列形式如SEQIDNo.2所示的序列，或与SEQIDNo.2所示序列存在1至3个碱基差异的序列；所述的双元Ti质粒载体为pCUbi1390Cas9-U6时，采用的CRISPR\Cas9系统sgRNA引导序列选自转义为DNA序列形式如SEQIDNo.3所示的序列，或与SEQIDNo.3所示序列存在1至3个碱基差异的序列。优选地，上述方法包含如下步骤：1)构建目标CRISPR双元Ti质粒载体；2)将载体转化至农杆菌中；3)采用农杆菌转化法转化水稻愈伤组织，获得T0代转化子；4)对T0代转化子中TDR基因的靶位点突变情况进行检测；5)观察转化子育性变化；6)加代繁殖转化子并从后代中筛选已经去除T-DNA成分且突变基因型为纯合功能失活突变型的单株；7)繁殖目标纯合单株。优选地，上述步骤1)又包含：1-1)设计sgRNA引导序列，合成用于克隆的寡脱氧核糖核酸：引导序列为SEQIDNo.2时，寡脱氧核糖核酸序列为gTDRU3-F：ggcaGCACAGGTCTCAGCACTGC，gTDRU3-R：aaacGCAGTGCTGAGACCTGTGC；引导序列为SEQIDNo.3时，寡脱氧核糖核酸序列为gTDRU6-F：cttgCTGCATTGAGGCCTCTAGT，gTDRU6-R：aaacACTAGAGGCCTCAATGCAG；1-2)分别把步骤1-1)合成的寡脱氧核糖核酸退火形成双链寡核酸接头；1-3)酶切和回收双元Ti质粒载体；1-4)将双元Ti质粒载体与接头连接：将gTDRU3-F和gTDRU3-R制作的接头与载体pCUbi1390Cas9-U3相连接，将gTDRU6-F和gTDRU6-R制作的接头与载体与pCUbi1390Cas9-U6相连接；1-5)将连接好的载体转化大肠杆菌，对大肠杆菌单克隆转化子进行测序，繁殖正确克隆，提取质粒备用。更优选地，步骤1-3)中，用限制性内切酶AarI酶切CRISPR/Cas9载体pCUbi1390Cas9-U3或pCUbi1390Cas9-U6。更优选地，步骤1-5)中，所用测序引物包括：检测克隆正确性，启动子为U3时用OsU3-F：GGCATGCATGGATCTTGGAGGAAT；启动子为U6时用OsU6-F：TTGAGCGATTACAGGCGAAAGTG；检测载体完整性，35S正向引物35S-F：TGACGCACAATCCCACTATCCTTC；cas95′端引物Cas9-R-1：TCGAGCCTGCGGGACTTAGAG；cas93′端引物C126：TCGTGAAGAAGACCGAGGTT。优选地，步骤4)中，通过DNA测序分析对T0代转化子中TDR基因的靶位点突变情况进行检测，所述突变情况包括：无突变，纯合突变、杂合突变、双等位基因突变和嵌合突变。优选地，步骤5)中通过以下方法观察转化子育性变化：用肉眼于开花当天或开花前1-3天直接观察，若花药室中存在黄色花粉则为可育，若无花粉则为不育；当植株为不育时，其突变类型可能为纯合突变、双等位基因突变或嵌合突变三种情况中的一种，当为可育时，突变类型可能为但不限于无突变或杂合突变两种情况中的一种。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.利用CRISPR\Cas9系统对水稻野生型TDR基因进行定点突变的方法，所述的TDR基因编码与SEQ ID No.1所示序列相同或存在95％以上序列相似性的水稻蛋白质序列，所述的CRISPR\Cas9系统采用的sgRNA引导序列包括转义为DNA序列形式表示的如SEQ ID No.2或SEQ ID No.3所示的任一序列，或与SEQ ID No.2或SEQ ID No.3所示序列存在1至3个碱基差异的序列。/n

【技术特征摘要】
1.利用CRISPR\Cas9系统对水稻野生型TDR基因进行定点突变的方法，所述的TDR基因编码与SEQIDNo.1所示序列相同或存在95％以上序列相似性的水稻蛋白质序列，所述的CRISPR\Cas9系统采用的sgRNA引导序列包括转义为DNA序列形式表示的如SEQIDNo.2或SEQIDNo.3所示的任一序列，或与SEQIDNo.2或SEQIDNo.3所示序列存在1至3个碱基差异的序列。


2.根据权利要求1所述的利用CRISPR\Cas9系统对水稻野生型TDR基因进行定点突变的方法，其特征在于，所述的CRISPR\Cas9系统的功能组分组装在双元Ti质粒载体中，所述的双元Ti质粒载体包括pCUbi1390Cas9-U3或pCUbi1390Cas9-U6。


3.根据权利要求2所述的利用CRISPR\Cas9系统对水稻野生型TDR基因进行定点突变的方法，其特征在于，所述的双元Ti质粒载体为pCUbi1390Cas9-U3时，采用的CRISPR\Cas9系统sgRNA引导序列选自转义为DNA序列形式如SEQIDNo.2所示的序列，或与SEQIDNo.2所示序列存在1至3个碱基差异的序列；所述的双元Ti质粒载体为pCUbi1390Cas9-U6时，采用的CRISPR\Cas9系统sgRNA引导序列选自转义为DNA序列形式如SEQIDNo.3所示的序列，或与SEQIDNo.3所示序列存在1至3个碱基差异的序列。


4.根据权利要求1所述的利用CRISPR\Cas9系统对水稻野生型TDR基因进行定点突变的方法，其特征在于，所述方法包含如下步骤：
1)构建目标CRISPR双元Ti质粒载体；
2)将载体转化至农杆菌中；
3)采用农杆菌转化法转化水稻愈伤组织，获得T0代转化子；
4)对T0代转化子中TDR基因的靶位点突变情况进行检测；
5)观察转化子育性变化；
6)加代繁殖转化子并从后代中筛选已经去除T-DNA成分且突变基因型为纯合功能失活突变型的单株；
7)繁殖目标纯合单株。


5.根据权利要求4所述的利用CRISPR\Cas9系统对水稻野生型TDR基因进行定点突变的方法，其特征在于，上述步骤1)又包含：
1-1)设计sgRNA引导序列，合成用于克隆的寡脱氧核糖核酸：
引导序列为SEQIDNo.2时，寡脱氧核糖核酸序列为
gTDRU3-F：ggcaGCACAGGTCTCAGCA...

【专利技术属性】
技术研发人员：龙起樟，黄永兰，万建林，王会民，芦明，唐秀英，朱雪晶，
申请(专利权)人：江西省超级水稻研究发展中心，
类型：发明
国别省市：江西;36