一种异源蛋白表达的滚环复制重组载体构建方法及其应用技术

本发明专利技术属于生物技术及植物学领域，更具体的说属于提供了一种用于异源蛋白表达的滚环复制重组载体的构建方法、重组载体及其应用。本申请通过提出的构建方法，构建了基于SPLCV序列为主的高效滚环复制瞬时表达载体，显著提升了异源核酸及蛋白在植物上持续时间和表达丰度，其结果具有高度的可重复性和可靠性。本发明专利技术提供的重组载体具有对异源蛋白极长表达时间(>20天相较于普通瞬时表达T载体)、极高表达丰度的载体(>30倍表达，相较于普通瞬时表达T载体)的分子工具载体，赋予了不同植物(烟草，甘薯，牵牛)的异源蛋白表达能力，弥补了相关植物对于利用瞬时表达研究基因功能的空白。

Construction and application of a recombinant vector of heterologous protein expression by rolling replication

【技术实现步骤摘要】
一种异源蛋白表达的滚环复制重组载体构建方法及其应用
本专利技术属于生物技术及植物学领域，更具体的说属于开发了一种在不同植物进行异源蛋白高效瞬时表达的滚环复制重组载体的构建方法、重组载体及应用。
技术介绍
利用植物进行异源蛋白表达是研究植物的通用研究技术，例如植物功能基因研究中通过使用模式植物(拟南芥、本氏烟)对非模式植物的未知基因进行表达从而验证其基因功能；利用植物反应器(菠菜、烟草)对某些药用蛋白进行表达并分离纯化目的蛋白。通过分子克隆方式获得具有能持续稳定进行外源基因表达的转基因植物是进行异源蛋白表达的最好方式；但是因其载体构建复杂，转化程序时间长(往往需要6-10个月)等因素影响，直接限制了该方法的使用。构建带有T-DNA插入区的瞬时表达载体是进行植物异源蛋白表达研究的备选方案，通过将构建完成的载体转化农杆菌后利用注射器直接侵染植物，可以使注射区域在一段时间内稳定持续的表达目的蛋白，该方法操作简单，时效性强，全部流程可能只需要10天左右即可完成；但是该方法也存在着一些固有缺陷，直接限制了该方法的使用：(1)持续时间短，蛋白的最长表本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种异源蛋白表达的滚环复制重组载体构建方法，其特征在于，所述的构建方法采用了在普通T-DNA载体pCambia0390中插入甘薯卷叶病毒复制子基因，使其成为具有甘薯卷叶病毒复制子基因的滚环复制载体，并预留部分酶切位点作为异源基因连入表达的靶位点。/n

【技术特征摘要】
1.一种异源蛋白表达的滚环复制重组载体构建方法，其特征在于，所述的构建方法采用了在普通T-DNA载体pCambia0390中插入甘薯卷叶病毒复制子基因，使其成为具有甘薯卷叶病毒复制子基因的滚环复制载体，并预留部分酶切位点作为异源基因连入表达的靶位点。


2.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述的构建方法采用植物内源启动子序列作为重组载体表达异源基因的启动子。


3.如权利要求1或2所述的构建方法，其特征在于，所述的构建方法采用反向SPLCV-IL作为滚环复制重组载体的串联接头，其基因序列如SEQIDNO:4；采用SPLCV基因组非编码区的部分序列构建终止子T-SPLCV-nIR，其基因序列如SEQIDNO：6。


4.如权利要求3所述的构建方法，其特征在于包括如下步骤：
步骤1)分别设计2对带有接头的克隆引物对SPLCV序列进行扩增，其中第一段扩增序列仅仅包括SPLCV-IL区域，第二段扩增序列包含SPLCV-IL-(AC1-AC4)-UTR区域；
步骤2)将步骤1)克隆获得的PCR产物纯化后分别连接进入预先利用限制性内切酶HindIII/BamHI双酶切后的pCambia0390中，获得命名为pCambia0390-SPLCV-mid的中间载体，其基因序列如SEQIDNO:11；连接方法为同源重组连接；
步骤3)将获得并测序验证无误的pCambia0390-SPLCV-...

【专利技术属性】
技术研发人员：余益成，孙健，李宗芸，
申请(专利权)人：江苏师范大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32