一种辣椒遗传转化体系的制备方法技术

本发明专利技术属于植物组织遗传领域，特别涉及一种辣椒遗传转化体系的制备方法。该方法包括：预培养、侵染、共培养、芽分化、芽伸长、生根、验证步骤，通过根癌农杆菌向辣椒中转入pCAMBIA1302双元质粒载体。本发明专利技术的制备方法不仅包括得到转基因植株的步骤，还包括对转基因植株的验证步骤，形成了完整的转基因体系，可实现转基因辣椒的快速培育，为辣椒基因功能组学的研究和育种奠定基础，从而培育出丰产、优质的辣椒新品种。

A preparation method of pepper genetic transformation system

【技术实现步骤摘要】
一种辣椒遗传转化体系的制备方法
本专利技术属于植物组织遗传领域，特别涉及一种辣椒遗传转化体系的制备方法。
技术介绍
转基因技术是利用重组DNA、细胞组织培养或种质系统转化等技术，将外源基因导入植物细胞或组织，使之定向重组遗传物质，改良植物性状，培育优质高产作物新品种的技术。转基因技术已成为植物分子生物学研究的强有力的实验手段，更是基因克隆、功能基因组研究必不可少的实验工具。这种技术和常规育种方法比较，所具特点有:1)不受亲缘关系的限制，可实现动植物和微生物间遗传物质的交流；2)有效地打破有利基因和不利基因的连锁，充分利用有用基因；3)加快育种进程，缩短育种年限。遗传转化方法为三类：1)农杆菌介导的基因转移；2)以原生质体、细胞或组织为受体的直接转移，如电激、微注射、PEG介导法；3)种质系统的基因转移，如利用子房注射、种胚、体细胞胚及花粉。目前应用最多的是根癌农杆菌介导的转基因方法，迄今所获得的200多种转基因植物中，80％以上是利用该方法获得的。辣椒为茄科辣椒属蔬菜作物在世界各地广泛种植，是一种非常重要的经济和营养蔬菜作物，在世界各地本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种辣椒遗传转化体系的制备方法，其特征在于：所述制备方法包括：/n预培养步骤：将辣椒外植体置于预培养基进行预培养，得到预培养外植体；/n侵染步骤：将所述预培养外植体于农杆菌侵染液中进行侵染，得到侵染后的外植体；/n共培养步骤：将所述侵染后的外植体移入共培养基进行共培养，得到共培养外植体；/n芽分化步骤：将所述共培养外植体移入选择性培养基进行选择性培养，再转入芽分化培养基进行芽分化培养，得到不定芽；/n芽伸长培养步骤：将所述不定芽移入芽伸长培养基进行芽伸长培养，得到伸长芽；/n生根培养步骤：将所述伸长芽移入生根培养基进行生根培养，得到转基因再生植株；/n优选地，所述农杆菌为根癌农杆菌，更优选...

【技术特征摘要】
1.一种辣椒遗传转化体系的制备方法，其特征在于：所述制备方法包括：
预培养步骤：将辣椒外植体置于预培养基进行预培养，得到预培养外植体；
侵染步骤：将所述预培养外植体于农杆菌侵染液中进行侵染，得到侵染后的外植体；
共培养步骤：将所述侵染后的外植体移入共培养基进行共培养，得到共培养外植体；
芽分化步骤：将所述共培养外植体移入选择性培养基进行选择性培养，再转入芽分化培养基进行芽分化培养，得到不定芽；
芽伸长培养步骤：将所述不定芽移入芽伸长培养基进行芽伸长培养，得到伸长芽；
生根培养步骤：将所述伸长芽移入生根培养基进行生根培养，得到转基因再生植株；
优选地，所述农杆菌为根癌农杆菌，更优选为LBA4404菌株；转入所述农杆菌的质粒载体为双元质粒载体，更优选为pCAMBIA1302质粒载体。


2.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于：所述外植体为辣椒子叶。


3.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于：所述预培养步骤中，所述预培养的时间为3-4天，优选为4天；光照条件为弱光，更优选为：在1800-2300LUX，优选2000LUX下，用薄纸覆盖培养器；温度为24-28℃，优选为25℃；
优选地，所述预培养基包括：在MS基本培养基的基础上，添加：吲哚乙酸至终浓度2-8mg/L，优选5mg/L，蔗糖至终浓度20-40g/L，优选30g/L，琼脂粉至终浓度5-10g/L，优选8g/L。


4.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于：所述侵染步骤中，所述农杆菌侵染液的制备方法包括：将含有质粒载体的单菌落接种于LB液体培养基，再培养至OD600值为0.4-0.6，优选为0.5，之后进行离心处理保留沉淀物，再向所述沉淀物中加入1/2MS液体培养基并混匀，得到所述农杆菌侵染液。


5.根据权利要求4所述制备方法，其特征在于：所述含有质粒载体的单菌落的制备方法包括：将保存在-80℃的农杆菌在冰上融化，加入质粒载体，再进行冰浴、冷冻、水浴、冰上静置；之后再加入LB液体培养基，再培养后离心取沉淀物，再将所述沉淀物重悬浮得到重悬浮液；再将所述重悬浮液涂布于含有LB固体培养基培养，至长出单菌落。


6.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于：所述共培养步骤中，
所述共培养的时间为1-3天，优选为2天，温度为25℃，光照条件为黑暗；
优选地，所述共培养基包括：在MS基本培养基的基础上，添加：6-苄氨基嘌呤至终浓度2-8mg/L，优选5mg/L，吲哚乙酸至终浓度2-8mg/L，优选5mg/L，蔗糖至终浓度20-40g/L，优选30g/L，琼脂粉至终浓度5-10g/L，优选8g/L。


7.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于：所述芽分化步骤中，
所述芽分化培养的时间为2-4周，优选为3周，温度为26-28℃，光照条件为每天16h光照8h黑暗，其间每5-7天，优选为每5天更换一次培养基；
优选地，所述芽分化培养基包括：在MS基本培养基的基础上，添加：6-苄氨基嘌呤至终浓度2-8mg/L，优选5mg/L，吲哚乙酸至终浓度2-8m...

【专利技术属性】
技术研发人员：张晓芬，耿三省，陈斌，杜和山，沙美宏，
申请(专利权)人：北京市农林科学院，
类型：发明
国别省市：北京;11