一种基于SaKKHn-pBE系统制备单突变体的方法技术方案

本发明专利技术公开了一种基于SaKKHn‑pBE系统制备单突变体的方法。所述单突变体的制备方法，包括如下步骤：将SaKKHn‑pBE碱基编辑系统导入生物体或生物细胞内，通过所述SaKKHn‑pBE碱基编辑系统实现基因组靶点序列的编辑，获得所述单突变体；所述单突变体为所述靶点序列中单个位点C突变为T的生物突变体；所述SaKKHn‑pBE碱基编辑系统包括SaKKHn蛋白质、tRNA‑sgRNA和PmCDA1蛋白质。通过本发明专利技术的方法对23个水稻基因组靶点序列进行测试，结果发现几乎所有靶点均能够获得突变效率最高的单位点C的单突变体，且其单突变体所占比例大多超过50％。

A method of single mutant preparation based on sakkhn PBE system

【技术实现步骤摘要】
一种基于SaKKHn-pBE系统制备单突变体的方法
本专利技术属于生物
，具体涉及一种基于SaKKHn-pBE系统制备单突变体的方法。
技术介绍
CRISPR-Cas9技术已经成为强有力的基因组编辑手段，被广泛应用到很多组织和细胞中。CRISPR/Cas9protein-RNA复合物通过向导RNA(guideRNA)定位于靶点上，切割产生DNA双链断裂(dsDNAbreak，DSB)，而后生物体会本能的启动DNA修复机制修复DSB。修复机制一般有两种，一种是非同源末端连接(non-homologousendjoining，NHEJ)，另一种是同源重组(homology-directedrepair，HDR)。通常情况下NHEJ占大多数，因此修复产生的随机的indels(insertionsordeletions)比精确修复高很多。对于碱基精确替换，因为HDR效率低以及需要DNA模板，所以使用HDR实现碱基精确替换的应用受到很大的限制。2016年，DavidLiu和AkihikoKondo两个实验室分别独立报道了两种不同类型的胞嘧啶碱基编辑器(cytosinebaseeditor，CBE)，分别使用了两种不同的胞苷脱氨酶rAPOBEC1(ratAPOBEC1)和PmCDA1(activation-inducedcytidinedeaminase(AID)orthologfromsealamprey)，原理都是通过使用胞苷脱氨酶直接实现对单个胞嘧啶(Cytosine，C)碱基进行编辑，而不再通过产生DSB和启动HDR修复，大大提高了C替换为胸腺嘧啶(Thymine，T)的碱基编辑效率。具体为deadCas9(dCas9)或theCas9nickase(Cas9n)连带着rAPOBEC1或PmCDA1通过sgRNA定位到靶点，rAPOBEC1或PmCDA1催化非配对的单链DNA上的C发生胞嘧啶脱氨反应变成尿嘧啶(Uracil，U)，通过DNA的修复使得U与腺嘌呤(Adenine，A)配对，又通过DNA复制，最终使得T与A配对，从而实现了C到T的转换。在所测试的编辑器中，SpCas9n(D10A)&rAPOBEC1/PmCDA1&UGI碱基编辑系统(其含有尿嘧啶DNA糖化酶抑制剂(uracilDNAglycosylaseinhibitor，UGI))的平均突变率较高，原因有二：一是UGI可以抑制尿嘧啶DNA糖化酶(uracilDNAglycosylase，UDG)催化清除DNA中U，二是SpCas9n(D10A)在非编辑链上产生切口，诱导真核错配修复机制或long-patchBER(base-excisionrepair)修复机制，促使U:G错配更多的偏好性修复成U:A。目前已经在动物和植物中开发了很多CBE，每个CBE都有其碱基编辑窗口，碱基编辑窗口内存在的C都有可能突变为T，即所获得的突变体群体中可能只是某一个位置C发生单突变，或是包含不同位置的C发生的多种单突变，也可能是不同位置的C共突变，也可能是单突变和多突变都包含。无论动物还是植物，实际应用中，为避免临近碱基突变所带来的潜在的、不定的负面影响，均期望能够获得所需突变碱基的精确突变，尽可能减少临近碱基的同时突变。目前关于植物中CBE产生何种突变类型的报道非常有限，已有报道中，并非所有的CBE对其编辑的靶点均能够获得单突变(Wu,Y.etal.(2019)IncreasingcytosinebaseeditingscopeandefficiencywithengineeredCas9-PmCDA1fusionsandthemodifiedsgRNAinrice.Front.Genet.10,379.)，或是有的靶点即使获得单突变，单突变体所占比例也不高(Zhang,C.etal.(2019)ExpandingthebaseeditingscopetoGAandrelaxedNGPAMsitesbyimprovedxCas9system.PlantBiotechnol.J.doi:10.1111/pbi.13259.[Epubaheadofprint]；Zong,Y.(2018)EfficientC-to-TbaseeditinginplantsusingafusionofnCas9andhumanAPOBEC3A.Nat.Biotechnol.36,950-953.)。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种单突变体的制备方法。为了实现上述目的，本专利技术提供了一种单突变体的制备方法。本专利技术提供的单突变体的制备方法包括如下步骤：将SaKKHn-pBE碱基编辑系统导入生物体或生物细胞内，通过所述SaKKHn-pBE碱基编辑系统实现基因组靶点序列的编辑，获得所述单突变体；所述单突变体为所述靶点序列中单个位点C突变为T的生物突变体；所述SaKKHn-pBE碱基编辑系统包括SaKKHn蛋白质、tRNA-sgRNA和PmCDA1蛋白质；所述tRNA-sgRNA靶向所述靶点序列；所述tRNA-sgRNA如式I所示：tRNA-所述靶点序列转录的RNA-sgRNA骨架(式I)；所述tRNA为m1)或m2)或m3)：m1)将序列1第474-550位中的T替换为U得到的RNA分子；m2)将m1)所示的RNA分子经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的RNA分子；m3)与m1)或m2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性且具有相同功能的RNA分子；所述sgRNA骨架为n1)或n2)或n3)：n1)将序列1第571-647位中的T替换为U得到的RNA分子；n2)将n1)所示的RNA分子经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的RNA分子；n3)与n1)或n2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性且具有相同功能的RNA分子。上述方法中，所述SaKKHn-pBE碱基编辑系统还包括UGI蛋白质。所述方法可为方法(一)或方法(二)或方法(三)或方法(四)：所述方法(一)包括如下步骤：将SaKKHn蛋白质的编码基因、转录tRNA-sgRNA的DNA分子和PmCDA1蛋白质的编码基因导入生物体或生物细胞内，使所述SaKKHn蛋白质、所述tRNA-sgRNA和所述PmCDA1蛋白质的编码基因均得到表达，实现基因组靶点序列的编辑，获得所述单突变体；所述方法(二)包括如下步骤：将SaKKHn蛋白质的编码基因、转录tRNA-sgRNA的DNA分子、PmCDA1蛋白质的编码基因和UGI蛋白质的编码基因导入生物体或生物细胞内，使所述SaKKHn蛋白质、所述tRNA-sgRNA、所述PmCDA1蛋白质和所述UGI蛋白质的编码基因均得到表达，实现基因组靶点序列的编辑，获得所述单突变体；所述方法(三)包括如下步骤：将SaKKHn蛋白质、tRNA-sgRNA和PmCDA1蛋白质导入生物体或生物细胞内，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种单突变体的制备方法，包括如下步骤：将SaKKHn-pBE碱基编辑系统导入生物体或生物细胞内，通过所述SaKKHn-pBE碱基编辑系统实现基因组靶点序列的编辑，获得所述单突变体；/n所述单突变体为所述靶点序列中单个位点C突变为T的生物突变体；/n所述SaKKHn-pBE碱基编辑系统包括SaKKHn蛋白质、tRNA-sgRNA和PmCDA1蛋白质；/n所述tRNA-sgRNA靶向所述靶点序列；/n所述tRNA-sgRNA如式I所示：tRNA-所述靶点序列转录的RNA-sgRNA骨架(式I)；/n所述tRNA为m1)或m2)或m3)：/nm1)将序列1第474-550位中的T替换为U得到的RNA分子；/nm2)将m1)所示的RNA分子经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的RNA分子；/nm3)与m1)或m2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性且具有相同功能的RNA分子；/n所述sgRNA骨架为n1)或n2)或n3)：/nn1)将序列1第571-647位中的T替换为U得到的RNA分子；/nn2)将n1)所示的RNA分子经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的RNA分子；/nn3)与n1)或n2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性且具有相同功能的RNA分子。/n...

【技术特征摘要】
1.一种单突变体的制备方法，包括如下步骤：将SaKKHn-pBE碱基编辑系统导入生物体或生物细胞内，通过所述SaKKHn-pBE碱基编辑系统实现基因组靶点序列的编辑，获得所述单突变体；
所述单突变体为所述靶点序列中单个位点C突变为T的生物突变体；
所述SaKKHn-pBE碱基编辑系统包括SaKKHn蛋白质、tRNA-sgRNA和PmCDA1蛋白质；
所述tRNA-sgRNA靶向所述靶点序列；
所述tRNA-sgRNA如式I所示：tRNA-所述靶点序列转录的RNA-sgRNA骨架(式I)；
所述tRNA为m1)或m2)或m3)：
m1)将序列1第474-550位中的T替换为U得到的RNA分子；
m2)将m1)所示的RNA分子经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的RNA分子；
m3)与m1)或m2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性且具有相同功能的RNA分子；
所述sgRNA骨架为n1)或n2)或n3)：
n1)将序列1第571-647位中的T替换为U得到的RNA分子；
n2)将n1)所示的RNA分子经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的RNA分子；
n3)与n1)或n2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性且具有相同功能的RNA分子。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述SaKKHn-pBE碱基编辑系统还包括UGI蛋白质。


3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述方法为方法(一)或方法(二)或方法(三)或方法(四)：
所述方法(一)包括如下步骤：将SaKKHn蛋白质的编码基因、转录tRNA-sgRNA的DNA分子和PmCDA1蛋白质的编码基因导入生物体或生物细胞内，使所述SaKKHn蛋白质、所述tRNA-sgRNA和所述PmCDA1蛋白质的编码基因均得到表达，实现基因组靶点序列的编辑，获得所述单突变体；
所述方法(二)包括如下步骤：将SaKKHn蛋白质的编码基因、转录tRNA-sgRNA的DNA分子、PmCDA1蛋白质的编码基因和UGI的编码基因导入生物体或生物细胞内，使所述SaKKHn蛋白质、所述tRNA-sgRNA、所述PmCDA1蛋白质和所述UGI蛋白质的编码基因均得到表达，实现基因组靶点序列的编辑，获得所述单突变体；
所述方法(三)包括如下步骤：将SaKKHn蛋白质、tRNA-sgRNA和PmCDA1蛋白质导入生物体或生物细胞内，实现基因组靶点序列的编辑，获得所述单突变体；
所述方法(四)包括如下步骤：将SaKKHn蛋白质、tRNA-sgRNA、PmCDA1蛋白质和UGI蛋白质导入生物体或生物细胞内，实现基因组靶点序列的编辑，获得所述单突变体。


4.根据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于：
所述SaKKHn蛋白质为A1)或A2)或A3)：
A1)氨基酸序列是序列2所示的蛋白质；
A2)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；
A3)在A1)或A2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；
和/或，所述PmCDA1蛋白质为C1)或C2)或C3)：
C1)氨基酸序列是序列3所示的蛋白质；
C2)将...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨进孝，张成伟，徐雯，吕欣欣，刘子争，
申请(专利权)人：北京市农林科学院，
类型：发明
国别省市：北京;11